Biochemisches Grundpraktikum

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1 Biochemisches Grundpraktikum Versuch Nummer G-01 01: Potentiometrische und spektrophotometrische Bestim- mung von Ionisationskonstanten

2 Gliederung: I. Titrationskurve von Histidin und Bestimmung der pk-werte... 2 a) Theoretische Grundlagen... 2 b) Versuchsziele, Aufgaben... 3 c) Versuchsdurchführung... 3 d) Meßergebnisse und Beobachtungen... 3 e) Auswertung und Diskussion... 4 II. Titration einer unbekannten Aminosäure... 4 a) Theoretische Grundlagen... 4 b) Versuchsziele, Aufgaben... 4 c) Versuchsdurchführung... 4 d) Meßergebnisse und Beobachtungen... 5 e) Auswertung und Diskussion... 6 III. Spektrophotometrische Bestimmung des pk-wertes von omphenolblau 6 a) Theoretische Grundlagen... 6 b) Versuchsziele, Aufgaben... 6 c) Versuchsdurchführung... 6 d) Meßergebnisse und Beobachtungen... 7 e) Auswertung und Diskussion

3 I. Titrationskurve von Histidin und Bestimmung der pk-werte a) Theoretische Grundlagen Aminosäuren sind aufgrund ihrer Amino- und Carboxylgruppe Ampholyte. Das heißt, sie können sowohl als Base (Protonenakzeptor) als auch als Säure (Protonendonor) fungieren. Enthält die Aminosäure keine protonierbare Seitenkette, so können + H 3 N C H COOH R pk H 3 N C H COO - H 2 N C H 1 + pk 2 - COO R konj. Säure Ampholyt konj. Base folgende ph-abhängige Protonierungsstufen auftreten: Ampholyte bilden Puffersysteme, bei denen eine Säure- oder Basenzugabe am Pufferpunkt nur sehr schwach den ph-wert beeinflußt. Wenn die Konzentration der undissoziierten Säure gleich der ihrer konjugierten Base ist, geben die pks-werte denjenigen ph-wert an, bei denen ein Proton abgegeben bzw. aufgenommen wird. Ansonsten berechnet man die pk-werte nach der HENDER- SON-HASSELBALCH-Gleichung: [HA] pk = ph + lg (1.1) - [A ] Experimentell werden die pk-werte mittels Titrationen bestimmt. Kennt man die Konzentrationen der vorgelegten Säure bzw. Base, so reicht eine Halbtitration. Ist die Konzentration nicht bekannt, so entnimmt man die Werte aus der Titrationskurve. Die pk-werte entsprechen, wie oben erwähnt, den ph-werten bei Halbtitration; sie liegen genau in der Mitte der beiden benachbarten Äquivalenzpunkte. Aus bekannten pk-werten kann der ph-wert einer wäßrigen Aminosäure-Lösung berechnet werden. Dazu addiert man die pk-werte der am ladungsneutralen Molekül beteiligten Gruppen und teilt durch zwei. Aus einer Titrationskurve kann die relative Molmasse berechnet werden. Dafür berechnet man, wieviele Mole des Titranten von Äquivalenzpunkt zu Äquivalenzpunkt verbraucht werden. Da die Einwaage der Aminosäure bekannt ist, muß man nur noch die in der untersuchten Lösung enthaltene Masse durch die zuvor berechnete Molzahl teilen und man erhält die Molmasse. Beispiel: Einwaage Aminosäure: 150 mg Volumen Aminosäure-Lösung: 50.0 ml Volumen untersuchte Lösung: 20.0 ml Konz. des Titranten: 0.1 M Volumen des verbr. Titranten: 15.5 ml Molzahl: 15.5 ml 0.1 M = 1.55 mmol 50.0 ml Molmasse: 150 mg!1.55 mmol = g mol ml Die untersuchte Aminosäure hat demnach eine Molmasse von ca. 242 Da. R - 2 -

4 b) Versuchsziele, Aufgaben Im ersten Teil des Versuchs soll zunächst eine Titrationskurve von Histidin aufgenommen werden. Anhand dieser sollen die pk-werte und zur Überprüfung der Genauigkeit die Molmasse ermittelt werden. c) Versuchsdurchführung Die Durchführung erfolgte gemäß den Angaben im Skript. d) Meßergebnisse und Beobachtungen In der folgenden Tabelle sind die gemessenen ph-werte in Abhängigkeit der Titrantenzugabe aufgeführt. Die graphische Auftragung wurde während der Messungen auf Millimeterpapier vorgenommen und ist als Anhang abgeheftet. NaOH HCl ml ph ml ph ml ph Tabelle I-1: Meßwerte - 3 -

5 e) Auswertung und Diskussion Der Verlauf der Titrationskurve entspricht sehr gut dem erwarteten Verlauf. Die drei Äquivalenzpunkte sind deutlich zu erkennen (die jeweilige Ionisationsform ist im Diagramm angegeben). In den Pufferbereichen ist die Änderung des ph-wertes mit fortschreitender Titration konstant gering. Hier sollen nochmals die im Diagramm angegebenen Werte zusammenfassend aufgeführt werden: berechnet Literatur 1 Abweichung pks1 ("-COOH) % pks2 (Seitenkette) % pks3 ("-NH2) % Molmasse / Da % Tabelle I-2: Ergebnisse Bis auf den pk-wert der Carboxylgruppe sind die Werte sehr gut. Die große Abweichung ist durch die fehlende Berücksichtigung des Wassers und der Volumenänderung zurückzuführen, die in diesem Bereich besonders stark sind. II. Titration einer unbekannten Aminosäure a) Theoretische Grundlagen Die theoretischen Grundlagen sind dieselben wie unter I. b) Versuchsziele, Aufgaben In diesem Teilversuch sollen mit derselben Verfahrensweise wie unter I. die pk- Werte und die Molmasse einer unbekannten Aminosäure bestimmt werden. c) Versuchsdurchführung Unterschiedlich zu den Angaben des Skripts wurde die vorgegebene Aminosäure auf einmal in 50 ml anstatt zur Hälfte in je 20 ml Wasser gelöst. Davon werden zwei Proben zu je 20.0 ml entnommen und titriert (eine mit HCl und eine mit NaOH). Diese Aufteilung hat den Vorteil, daß zwei identische Konzentrationen der Aminosäure vorliegen. 1 Stryer: Biochemie, 4. Auflage, Spektrum Verlag - 4 -

6 d) Meßergebnisse und Beobachtungen Auch für diese Meßreihe sind die Daten in einer Tabelle aufgeführt: HCl NaOH ml PH ml ph ml ph ml ph Tabelle II-1: Meßwerte - 5 -

7 e) Auswertung und Diskussion Der anfängliche niedrige ph-wert läßt nur zwei Aminosäuren in Frage kommen: Entweder handelt es sich um Glutamat oder Aspartat. Aufgrund der ausgerechneten Molmasse muß es sich um Glutamat handeln (s.u.). Die Titrationskurve entspricht den Erwartungen. Während der zweite Äquivalenzpunkt gut zu erkennen ist, ist die Auswertung des ersten recht ungenau. Zusammengefaßte Ergebnisse: berechnet Literatur 2 Abweichung pks1 ("-COOH) % pks2 (Seitenkette) % pks3 ("-NH2) % Molmasse / Da % Tabelle II-2: Ergebnisse III. Spektrophotometrische Bestimmung des pk-wertes von omphenolblau a) Theoretische Grundlagen Bei omphenolblau handelt es sich um einen Triarylmethanfarbstoff. Bei ph=3.0 ist er gelb, bei ph=4.6 purpur. Die Farbänderung ist auf die Verlängerung des chromophoren Systems zurückzuführen: SO 2 O HO O HO OH -H+ +H+ SO 3 H gelb Abb. III-1 : Struktur von omphenolblau purpur b) Versuchsziele, Aufgaben Von Puffern mit verschiedenen ph-werten werden nach Zugabe von omphenolblau die Extinktionen bei 430 nm und 590 nm gemessen. Anschließend wird eine Extinktionskurve von drei verschiedenen Lösungen (ph 2.4, ph 3.8 und ph 5.2) im Bereich von 310 nm bis 660 nm aufgenommen. Daraus sollen die molaren Extinktionskoeffizienten ermittelt und die Annahme untersucht werden, daß die Absorptionsverläufe zur genauen Bestimmung herangezogen werden können. c) Versuchsdurchführung Wie im Skript beschrieben wurden die Extinktionen bei 430 nm und 590 nm gemessen und danach des Absorptionsspektrum bei drei ph-werten (2.4, 3.8 und 5.2) aufgenommen. 2 Stryer: Biochemie, 4. Auflage, Spektrum Verlag - 6 -

8 d) Meßergebnisse und Beobachtungen In der nachfolgenden Tabelle sind die gemessenen Extinktionen aufgelistet. Schon mit bloßem Auge war eine gleichmäßige Farbänderung von gelb über grün nach violett-blau zu erkennen. ph E430 E Tabelle III-1: Extinktionen von omphenolblau Die aufgenommenen Absorptionsspektren sind angehängt. e) Auswertung und Diskussion Für die folgenden Berechnungen muß zuerst die analytische Konzentration des Farbstoffs ausgerechnet werden. Dazu wird die im Reaktionsansatz vorhandene Menge auf das untersuchte Volumen bezogen und durch die Molmasse des omphenols geteilt. Als Ergebnis erhält man so eine Konzentration von -6 mg l 6-1 c = 1 = mol l -3-1 ml l 670 g mol Über das LAMBERT-BEERsche-Gesetz können die molaren Extinktionskoeffizienten bestimmt werden: E = c d ε E ε = c d Die Werte aus Tabelle III-2, S. 8 wurden nach dieser Formel berechnet. Die Auswertung der molaren Extinktionskoeffizienten erfolgte mit Hilfe der aufgenommenen Absorptionsspektren; die Ergebnisse sind: ph=2.4, 430 nm: #1 = l (mol cm) -1 ph=5.2, 590 nm: #2 = l (mol cm) -1 Die Werte liegen recht hoch, was eine niedrige Nachweisgrenze möglich macht. Wie in Diagramm III-1, S. 8 zu erkennen ist, überschneiden sich die Extinktionen der verschiedenen Wellenlängen mit zunehmendem ph-wert. Der Einfluß ist allerdings gering, was das Absorptionsspektrum der ph = 3.8 Lösung zeigt. Die Annahme, daß der Farbstoff als Indikator zu verwenden ist, ist also recht gut erfüllt. Besonders bei höheren ph-werten verschwindet die Absorption bei niedrigen Wellenlängen

9 log(#-#1)/(#2-#) ph $ #430 $ #590 E430 E Tabelle III-2 : Berechnete Werte Zur Bestimmung des pks-wertes ist es zweckmäßig, eine logarithmische Auftragung vorzunehmen, in die die Verfälschung mit eingeht. Als molare Extinktionskoeffizienten wurden die roten (= #1) und die blauen (= #2) Werte aus Tabelle III-2 benutzt. Durch die Nullstellen der Auftragung (Diagramm III-2, S. 9) erhält man zwei Werte für den pks. Der Mittelwert ist ( )/2 = Extinktionen von omphenolblau Extinktion E430 E ph-wert Diagramm III-1: Extinktionen - 8 -

10 Bestimmung des pk S -Wertes y = 1.236x y = x log((e-e1)/(e2-e)) ph-wert -0.5 e430 e590 Linear (e590) Linear (e430) Diagramm III-2 : Logarithmische Auftragung - 9 -