QUANTA Lite TM ANA ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 QUANTA Lite TM ANA ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck QUANTA Lite TM ANA ist ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) für die semi-quantitative Bestimmung von Anti-nukleäre Antikörper (ANA) in humanem Serum. Die Anwesenheit von ANA kann in Verbindung mit den klinischen Daten des Patienten und anderen Labortests bei der Diagnosestellung von rheumatischen Erkrankungen wie systemischen Lupus erythematodes, Sjögren Syndrom, Sklerodermie und Mischkollagenosen eine große Hilfe sein. Der Test kann in einer einzelnen Kavität folgende Anti-nukleäre- Antikörper erkennen: Chromatin (dsdna und Histone), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Zentromer und PCNA sowie Antikörper gegen diagnostisch wichtige, zytoplasmatische Antigene wie Jo-1, Mitochondrien (M-2) und Ribosome (P0, P1 und P2). Nicht identifizierte Antigene, die auf HEp-2 Zellen ein positives Ergebnis zeigen, werden ebenfalls erfasst. Informationen zum Test Die Anwesenheit von ANA ist wichtig bei der Bestimmung von systemischen Autoimmunerkrankungen. 1-4 Üblicherweise werden ANA mit der indirekten Immunfluoreszenz (IFT) auf HEp-2 Zellen nachgewiesen. 3 Das weitere Vorgehen bei ANA-positiven Seren erfolgt mittels (ELISA), Western Blot oder Immunpräzipitation, um spezifische Autoantikörper in diesen Seren nachweisen zu können. 1-4 Vor kurzem wurden diagnostisch relevante Antigene und zusätzliche Extrakte von HEp-2 Zellen in ELISAs zum Nachweis von ANA eingesetzt. 5-9 Folgende Vorteile bietet der ANA ELISA gegenüber dem IFT: Einfache Durchführbarkeit, Personen-unabhängige Beurteilung, quantitative Resultate und eine geringe Anzahl biologisch falsch-positiver Ergebnisse. Folgende Nachteile gibt es gegenüber der IFT: Geringere Sensitivität in bezug auf unbekannte nukleäre und zytoplasmatische Antigene und keine Aussage über die üblicherweise vorhandenen Fluoreszenzmuster. Die diagnostische Aussagekraft unbekannter Antigen-Spezifitäten darf jedoch nicht zu hoch eingeschätzt werden, da es bei Gesunden eine hohe Rate positiver Ergebnisse auf der HEp-2 Zelle und negativer Ergebnisse spezifische Antigene gibt Sobald ein spezifisches Antigen identifiziert worden ist, ist das Fluoreszenzmuster für die Diagnose obsolet. Somit hat der ANA ELISA einen berechtigten Stellenwert in der Autoimmundiagnostik. Testprinzip Hochgereinigte einzelne Antigene und Extrakte von Nuklei und Nukleoli wurden an die Kavitäten der Polystyrol-Mikrotiterplatte gebunden. Folgende Antigene wurden verwendet: Chromatin (dsdna und Histone), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Zentromer, PCNA, Jo-1, Mitochondrien (M-2) und Ribosome, nukleäre und nukleoläre Extrakte. Anti-Chromatin Antikörper stellen sowohl einen sensitiven als auch einen frühen Marker für SLE dar. 13 Vorverdünnte Kontrollen und verdünnte Patientenseren werden in verschiedene Kavitäten pipettiert. Die vorhandenen ANA Antikörper binden an das Antigen. Der Rest der Probe/Kontrolle wird durch Waschen entfernt. Enzymmarkiertes anti-humanes IgG wird in die Kavitäten pipettiert und bindet während einer zweiten Inkubation an den Patienten-Antikörper. Nachdem in einem weiteren Waschschritt das restliche Konjugat entfernt worden ist, wird ein Chromogen-Substrat zugegeben. Die Intensität der entstandenen Farbreaktion wird nach dem Abstoppen mit dem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen. Die quantitative Auswertung erfolgt durch einen Vergleich der Extinktionswerte der Patienten mit dem Wert eines Kalibrators. Inhalt der Testpackung 1. Mikrotiter-ELISA-Platte beschichtet mit hochgereinigtem Nukleäre und zytoplasmatische Antigene (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter in Folienverpackung und Trockenmittel 2. ELISA Negative Kontrolle, 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum ohne humane Antikörper gegen Nukleäre und zytoplasmatische Antigene, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 3. ANA ELISA Low Positive (Kalibrator), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen Nukleäre und zytoplasmatische Antigene, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 4. ANA ELISA High Positive (positive Kontrolle), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum mit Antikörpern gegen Nukleäre und zytoplasmatische Antigene, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 5. HRP Probenverdünner, 1 Flasche rosa gefärbt mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 ml 6. HRP Waschkonzentrat, 1 Flasche mit 40fachem Konzentrat rot gefärbt mit gepufferter Kochsalzlösung und Tween 20, 25 ml. Zur Verdünnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. 7. HS HRP IgG Konjugat, (Ziege), anti-humanes IgG, 1 Flasche purpurrot gefärbt mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 ml 8. TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 ml 9. HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure, 1 Flasche farblos, 10 ml 1

2 Hinweise 1. VORSICHT: Probenverdünner, Kontrollen und Konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US-Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, daß dieser Stoff Krebs verursachen kann. 2. Alle Reagenzien für die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden NaN 3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 4. Das HRP Konjugat enthält eine verdünnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 5. Das TMB Chromogen enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 6. Die HRP Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Schwefelsäure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 7. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 8. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges Waschen und ungenügendes Entfernen der Flüssigkeiten aus den ELISA Kavitäten führt zu einer schlechten Präzision und zu hohen Hintergrund-Extinktionen. 4. Die Adaptation dieses Testsystems auf automatische Probenverarbeitung und andere Instrumentierung, ganz oder teilweise, kann unterschiedliche Ergebnisse zur manuellen Durchführung ergeben. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Bearbeitung so zu überprüfen, daß Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. 5. Eine Reihe von Faktoren beeinflusst das Testergebnis. Hierzu zählen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Pipettierung, der Typ des verwendeten Photometers, die Temperatur der Reagenzien, die Umgebungs-Temperatur, die Gründlichkeit des Waschens und der Entfernung der Flüssigkeiten aus den Vertiefungen der ELISA-Streifen, und die Einhaltung der Inkubationszeiten. Es ist deshalb sehr wichtig, für gleichbleibende Bedingungen zu sorgen. 6. Die strikte Einhaltung der Testprozedur wird empfohlen. Jede Änderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. 7. Das unvollständige Verschließen der Mikrotiterkavitäten und des Trockenmittels führt zu Antigenabbau und schlechter Präzision. 8. Eine unakzeptabel niedrige Absorption kann beobachtet werden, wenn eine Flasche HRP Konjugat bei zwei- oder mehrfachem Gebrauch über einen längeren Zeitraum benutzt wird. Daher ist es wichtig, die Hinweise zum Umgang mit dem HRP Konjugat genau zu beachten. 9. Chemische Kontamination des HRP Konjugates kann durch unzureichendes Reinigen oder Spülen der Ausrüstung oder der Instrumente verursacht werden. Rückstände gebräuchlicher Laborchemikalien wie z.b. Formalin, Bleichmittel, Ethanol oder Spülmittel führen zum Abbau des HRP Konjugates im Verlauf der Zeit. Das gründliche Spülen der gesamten Ausrüstung und Instrumentierung nach Verwendung chemischer Reinigungsmittel ist daher unbedingt erforderlich. Lagerung 1. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung. 2. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen. 3. Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Proben Die Testdurchführung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, können die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hämolytische, lipämische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das NCCLS Dokument H18-A2 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen für Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht länger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8 C kühl lagern. 3) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei -20 C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor der Testung gut geschüttelt werden. 2

3 Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material 1 ANA ELISA Mikrotiterplatte (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter 1 1,2 ml vorverdünnte ELISA Negative Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte ANA ELISA Low Positive Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte ANA ELISA High Positive Kontrolle 1 50 ml HRP Probenverdünner 1 25 ml HRP Waschkonzentrat, 40faches Konzentrat 1 10 ml HS HRP IgG Konjugat (von der Ziege), anti-humanes IgG 1 10 ml TMB Chromogen 1 10 ml HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure Zusätzliches benötigtes Material Pipetten für 5, 100, und 500 µl Einmal-Pipettenspitzen Eppendorf-Reaktionsgefäße für die Serumverdünnung, 4 ml Volumen Distilliertes oder deionisiertes Wasser 1 L Gefäß für verdünntes HRP Waschkonzentrat Reader für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (und 620 nm für eine bichromatische Messung) Methode Testvorbereitung 1. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20-26 o C) und gründlich mischen. 2. Den gesamten Inhalt (25 ml) des Waschkonzentrats mit 975 ml Aqua dest. mischen (1:40 Verdünnung). Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so können für einen Ansatz von 16 Kavitäten 2 ml Konzentrat mit 78 ml Aqua dest. gemischt werden. 3. Eine 1:41 Verdünnung von jeder Patientenprobe herstellen, indem man 10 μl der Probe mit 400 μl des ANA Probenverdünners mischt. Die ANA ELISA Low Positive Kontrolle, die ANA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle nicht verdünnen.verdünnte Proben sollen innerhalb von 8 Stunden getestet werden Hinweis: In ANA Probenverdünner 1:41 verdünnte Proben, können falls erwünscht, direkt auf HEp-2 Zellsubstrat pipettiert werden, um positive ANA und ANA Muster bestätigen zu können. Positive Proben können austitriert werden unter Verwendung von PBS als Verdünnungspuffer. Andere Patientenverdünnungen als 1:41 wurden mit diesem Puffer nicht durchgeführt. 4. Jeder Test benötigt zwei Kavitäten für jede der drei Kontrollen sowie eine oder zwei Kavitäten für die Patientenprobe (Es wird empfohlen, alle Proben in Doppelbestimmung anzusetzen, bis die erforderliche Präzision und Reproduzierbarkeit erreicht sind). Testdurchführung 1. ALLE REAGENZIEN UND PATIENTENPROBEN AUF RAUMTEMPERATUR (20-26 C) BRINGEN. Die entsprechende Anzahl Mikrotiterkavitäten abbrechen. Die Kavitäten im Rahmen befestigen. Die unbenutzten Kavitäten wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen, um Verdunstung zu minimieren. 2. Je 100 µl der gebrauchsfertigen ANA ELISA Low Positive Kontrolle, der ANA ELISA High Positive Kontrolle, der ELISA Negative Kontrolle und der verdünnten Patientenproben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Die Inkubationszeit beginnt nach Zugabe der letzten Probe. 3. Waschen: Den Inhalt aller Kavitäten absaugen. Die Kavitäten vollständig ( µl) mit verdünntem HRP Waschpuffer füllen und dann gründlich absaugen. Diesen Waschschritt noch zweimal wiederholen (Insgesamt: drei Waschschritte). Anschließend die Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um restliche Waschflüssigkeit zu entfernen. Die Waschschritte sind in der selben Reihenfolge wie die Pipettierschritte durchzuführen μl des HS HRP IgG Konjugates in jede Kavität geben. Sterile Pipetten verwenden! Nur das benötigte Volumen an Konjugat aus der Flasche entnehmen. UNBENUTZTES KONJUGAT NICHT IN DIE FLASCHE ZURÜCKPIPETTIEREN. KONTAMINATIONSGEFAHR!! Abgedeckte Streifen bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren, wie in 2. beschrieben. 5. Waschen: Schritt Nr. 3 wiederholen µl TMB Chromogen in jede Kavität geben. 30 Minuten im Dunkeln bei Raum-temperatur inkubieren µl HRP Stopplösung in jede Kavität pipettieren. Bei der Hinzugabe der Stopplösung dieselbe Reihenfolge und Zeitplan wie bei der Hinzugabe des TMB Chromogens einhalten. Die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln. 8. Die optische Dichte (OD) jeder Kavität bei 450 nm innerhalb einer Stunde nach Abstoppen der Reaktion ablesen. Es wird eine bichromatische Messung mit 620 nm als Referenzwellenlänge empfohlen. 3

4 Qualitätskontrolle 1. Die ANA ELISA Low Positive Kontrolle, die ANA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden, um sicher-zustellen, daß alle Reagenzien und der Testansatz insgesamt ordnungsgemäß funktionieren. 2. Da die ANA ELISA Low Positive Kontrolle, die ANA ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle vorverdünnt sind, entfällt der Verdünnungsschritt der Patientenproben für die Kontrollen. 3. Zusätzliche Kontrollen zur Qualitätssicherung können gemäß den Richtlinien nationaler oder internationaler Regulierungs- oder Akkreditierungsbehörden eingesetzt werden. Geeignete Kontrollen können aus Humanserum gewonnen und bei <-20 C gelagert werden. 4. Um sicher zu sein, daß alle Patientenwerte korrekt sind, müssen die nachfolgenden Kriterien erfüllt werden (Wurden ein oder mehrere Kriterien nicht erfüllt, so ist das Ergebnis als ungültig zu betrachten und der Testansatz ist zu wiederholen). a. Die Absorption der vorverdünnten ANA ELISA High Positive Kontrolle muß größer sein als die Absorption der vorverdünnten ANA ELISA Low Positive Kontrolle. Die Absorption der Low Positive Kontrolle wiederum muß größer sein als die der vorverdünnten ELISA Negativkontrolle. b. Die Absorption der vorverdünnten ANA ELISA High Positive Kontrolle muß größer als 1,0 sein, die Absorption der vorverdünnten Negative Kontrolle darf nicht größer als 0,15 sein. c. Die Absorption der ANA ELISA Low Positive Kontrolle muß mehr als doppelt so hoch sein wie die der ELISA Negative Kontrolle sein oder über 0,15. d. Die ELISA Negative Kontrolle und die ANA ELISA High Positive Kontrolle dienen der Sicherstellung der ordnungsgemäßen Funktionsweise des Testansatzes. Die ANA ELISA High Positive Kontrolle stellt die Präzision am Cut-off des Tests nicht sicher. e. Der Anwender sollte unter anderem das NCCLS Dokument Nr. C24-A für zusätzliche Hinweise zur zeitgemäßen Qualitätskontrolle beachten. Berechnung der Ergebnisse Zunächst sind die Mittelwerte der OD für die Doppelbestimmungen zu berechnen. Alle weiteren Berechnungen werden dann mit den entsprechenden Mittelwerten durchgeführt. Die Reaktivität jeder Patientenprobe wird bestimmt durch die Division des Mittelwertes der Proben-OD durch den Mittelwert der Low Positive Kontrolle und der Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem chargenspezifischen Wert der ANA ELISA Low Positive Kontrolle. Die chargenspezifischen Werte sind auf dem Fläschchenetikett aufgedruckt. OD der Probe Probenwert = x ANA ELISA Low Positive Kontrollwert (Units) ANA ELISA Low Positive Kontrolle OD Wert (Units) Die Reaktivität verhält sich zur Konzentration der vorhandenen Antikörper nicht linear. Zunahme und Abnahme der Antikörperkonzentrationen von Patienten werden durch einen entsprechenden Anstieg oder Abfall der Reaktivität angezeigt, diese Änderungen sind jedoch nicht proportional (d.h. eine Verdoppelung der Antikörperkonzentration führt nicht zu einer Verdoppelung der Reaktivität). Wird eine genauere Quantifizierung der Patientenantikörper gewünscht, sind serielle Verdünnungen der Probe durchzuführen und der Titer der zuletzt als positiv gemessen wurde, sollte als Patienten-Antikörpertiter bewertet werden. Interpretation der Ergebnisse Dieser ELISA-Test ist sehr sensitiv und in der Lage, sogar kleine Unterschiede in Patientenpopulationen zu messen. Die folgenden Werte dienen als Beispiel für die Interpretation der Testergebnisse. Es wird empfohlen, daß sich jedes Labor seine eigenen Normalwerte, basierend auf eigener Technik, Kontrollen, Ausrüstung und Patientenpopulation erarbeitet. Die Patientenprobe kann anschließend als negativ, deutlich positiv bis stark positiv klassifiziert werden. Units Negativ <20 Deutlich positiv Stark positiv >60 1. Ein positives Ergebnis zeigt das Vorhandensein von ANA Antikörpern an und legt die Möglichkeit des von rheumatischen Erkrankungen wie systemischen Lupus erythematodes, Sjögren Syndrom, Sklerodermie und Mischkollagenosen eine große Hilfe sein. 2. Ein negatives Ergebnis deutet auf das Nichtvorhandensein von ANA Antikörpern hin oder auf Konzentrationen unterhalb der Erfassungsgrenze des Testsystems. 3. Wir schlagen vor, die Laborergebnisse mit folgendem Hinweis zu versehen: Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA erzielt. ANA Werte, die mit Testsystemen anderer Hersteller ermittelt wurden, können nicht untereinander ausgetauscht werden. Die Höhe des gefundenen IgG-Titers kann nicht mit einem Endpunkttiter in Korrelation gebracht werden. 4

5 Grenzen des Verfahrens 1. Immunkomplexe oder andere Immunoglobulin-Aggregate im Patientenserum können nichtspezifische Bindungen und falsch-positive Ergebnisse hervorrufen. 2. Nicht alle Patienten mit Bindegewebserkrankungen weisen Anti-nukleäre-Antikörper auf. 3. Ergebnisse dieses Testes müssen im Zusammenhang mit klinischen Ergebnissen und anderen serologischen Tests verwendet werden. 4. Die Spezifität der Antikörper in einem positiven Serum kann mit diesem Test nicht bestimmt werden. Weitere Tests zum Nachweis von spezifischen Antikörpern werden empfohlen. 5. Die ANA ELISA Low und ANA ELISA High Kontrolle wurde aus Patientenserum mit Antikörpern gegen RNP hergestellt. Das Antigen RNP ist bekanntermaßen empfindlich für Zersetzung. Somit geben diese Kontrollen die Integretät des Antigens sehr gut wider. Es können nach Ermessen der einzelnen Labors weitere Kontrollen zum Monitoring der Werte der verschiedenen Antigene hinzugefügt werden 6. Die Leistungscharakteristika für andere Untersuchungsmaterialien als Serum wurden nicht bestimmt. Erwartungswerte Normalbereich Der Cutoff beträgt 20 Units. 246 zufällig ausgewählte Normalseren wurden getestet. Die Gruppe setzte sich aus 65% Frauen und 35% Männern im Alter von 18 bis 75 Jahren, wobei das Durchschnittsalter 38 Jahre betrug, zusammen. 23 (9,4%) hatten ein positives Ergebnis, was einer Spezifität von 90,6% entspricht. Sechs dieser ELISA positiven Ergebnisse zeigten ein positives Ergebnis auf der HEp-2 Zelle, zwei davon hatten die höchsten gefundenen Werte im ANA ELISA dieser Gruppe mit 40 und 50 Units. Berücksichtigt man diese sechs Seren, dann waren nur 6,9% biologisch falsch-positiv. Die verbleibenden positiven Ergebnisse der Normalseren hatten alle Werte unter 35 Units. Ca. 60% der Normalseren hatten Werte unter 10 Units. Relative Sensitivität und Spezifität Vergleich mit einem anderen Referenz ANA ELISA Klinisch definierte Proben wurden mit dem INOVA QUANTA Lite ANA ELISA und einem Referenz ANA ELISA getestet. Die Ergebnisse für Normalseren und Seren von Patienten mit SLE, Sjögren Syndrom und Sklerodermie-Patienten sind unterhalb dargestellt. Zusätzlich wurden Seren im ELISA getestet, von denen bekannt ist, dass sie Antikörper-reaktiv sind mit SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Chromatin, Ribosom P und M2 by ELISA. Des weiteren wurden Seren getestet, die positiv in der Immunofluoreszenz oder im Western Blot für Zentromere, P-80 Coilin, Nukleoli und PCNA waren. Die Testkits ergaben nahezu identische Ergebnisse. Wie in der Übersicht dargestellt, beträgt die relative Sensitivität 89% und die relative Spezifität 89%. Vergleich von Gesunden im und einem Referenz ANA ELISA Normalseren n=134 Negativ 106 6** Referenz ANA ELISA Positiv 13* 9*** * Diese Proben hatten 1 bis 1,6 Referenz-Units, gleichbedeutend mit 20 bis 33 INOVA Units. Vier der Proben waren ANA-positiv im IFT auf HEp-2 Zellen. ** Diese Proben lagen im Bereich von 20 bis 25 INOVA Units. Zwei Proben waren ANA-positiv im IFT. *** Drei dieser Proben waren ANA-positiv im IFT. Vergleich von Patienten mit systemischen rheumatischen Erkrankungen (SRD), gemessen mit INOVA SRD n=100 Negativ 4* 1 Referenz ANA ELISA Positiv 6 89 * Eine dieser Proben war negativ im Immunfluoreszenz-Test (IFT) auf HEp-2 Zellen. Vergleich von Proben einer definierten Spezifität mit dem INOVA QUANTA Lite ANA und einem Referenz n=74 Negativ 2* 7*** Referenz ANA ELISA Positiv 1** 64 * Es gab 1 PCNA und 1 Scl-70 Probe, die beide ANA-positiv im IFT auf HEp-2 Zellen. ** Diese Probe war positiv mit nukleolärem Muster im IFT. *** Diese Proben beinhalteten 1 Scl-70, 1 RNP, 1 M2 und 4 Jo-1 Proben, die alle niedrig bis mittelstark positiv im waren. Die Scl-70 und RNP Proben waren ANA positiv auf HEp-2 Zellen. Die anderen waren ANA-negativ, aber schwach zytoplasmatisch positiv im IFT, wie erwartet. 5

6 Vergleich zwischen dem QUANTA Lite ANA ELISA und IFT auf NOVA Lite HEp-2 Zellen Alle Normalseren und klinisch definierte Proben, die im INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA getestet wurden, wurden ebenfalls im IFT mit NOVA Lite HEp-2 Zellen von INOVA untersucht. Zur Sicherstellung von unparteiischen Ergebnissen wurden die IFT-Ansätze ohne Angabe der Probenidentität durchgeführt. Wie in der folgenden Tabelle ersichtlich ist, ergibt der ANA-ELISA signifikant weniger ANA-positive Ergebnisse für die gesunde Population als die IFT-Technik. Zusätzlich, wie in der zweiten Tabelle dargestellt, ist der ELISA nahezu so sensitiv wie die HEp-2-Technik im Nachweis von ANA in Patienten mit SLE, Sjögren Syndrom und Sklerodermie. Vergleich von Gesunden im QUANTA Lite und auf INOVA NOVA Lite TM HEp-2 Zellen Normalseren n=134 Negativ 91 10* IFA auf HEp-2 Zellen Positiv 28 5 * Diese Proben hatten alle einen Wert von weniger als 35 Units. Vergleich von Patienten mit systemischen rheumatischen Erkrankungen (SRD) im QUANTA Lite TM und auf INOVA NOVA Lite TM HEp-2 Zellen SRD n=100 Negativ 1 3** IFA auf HEp-2 Zellen Positiv 9* 87 * Jeweils 3 Proben von Patienten mit SLE, Sjögren Syndrom und Sklerodermie hatten auf HEp-2 Zellen fast alle ein schwach positives Resultat. ** Diese drei Seren stammten von SLE-Patienten. Eines hatte ein zytoplasmatisches Fluoreszenzbild mit anti-ribosomalen Antikörpern. Vergleich von Puffern für den IFT auf HEp-2 Zellen Für den Fall, dass im QUANTA Lite TM ANA ELISA das Screening vorgenommen werden, und eine Bestätigung der positiven Ergebnisse auf der HEp-2 Zelle erfolgen soll, kann zur einfachen Handhabung der ANA ELISA Probenverdünner auch als Verdünnungsmedium für die übliche IFT verwendet werden. Für den Fall, dass im QUANTA Lite TM ANA ELISA das Screening vorgenommen werden, und eine Bestätigung der positiven Ergebnisse auf der HEp-2 Zelle erfolgen soll, kann zur einfachen Handhabung der ANA ELISA Probenverdünner auch als Verdünnungsmedium für die übliche IFT verwendet werden. Ein Teil der Proben (97), die auf der HEp-2 Zelle mit dem ANA ELISA Verdünnungspuffer untersucht wurden, wurden ebenfalls mit dem üblichen PBS Puffer verdünnt und untersucht. In der Gruppe der systemisch rheumatisch Erkrankten stimmten alle Ergebnisse überein, mit Ausnahme von 5 Proben. Der ANA ELISA Puffer vermindert die Hintergrund-Anfärbung, die bei 3 Proben eine so starke zytoplasmatische Anfärbung verursachte, dass die ANA Beurteilung mit üblichem PBS Puffer zu einem negativen ANA Ergebnis führte. Bei zwei anderen Proben wurde die nukleäre Fluoreszenz vermindert, so dass aus einem schwach positiven Ergebnis mit PBS Puffer ein negatives Ergebnis mit ANA ELISA Puffer wurde. In der Gruppe der Normalbevölkerung war der Unterschied größer, da schwach positive schwieriger als eindeutig positive Fluoreszenzbilder zu beurteilen sind. Mit dem PBS Puffer verdünnte Seren ergaben eine Positivrate von 33 %, die mit ANA ELISA Puffer verdünnten Seren eine Rate von 26 %. Eine kürzlich veröffentlichte Untersuchung findet bei Gesunden eine Rate von 30 % positiven Ergebnissen bei einer Verdünnung von 1: Vier positive Proben ursprünglich mit dem ANA ELISA Puffer 1:40 verdünnt, wurden durch eine Serienverdünnung mit PBS austitriert. Die Endpunkttiter lagen innerhalb einer Titerstufe der Seren, die von Anfang an mit PBS verdünnt wurden. Es wurden nur Verdünnungen 1:41 mit dem ANA ELISA Puffer untersucht Klinische Sensitivität und Spezifität positiv Patientengruppe Gesamtanzahl Anzahl % Normalseren % Klinisch definierte Patienten SLE % Sjögren Syndrom % Sklerodermie % Definierte Antigene* % 6

7 * Es wurden jeweils zwischen 4 und 9 mit definierte Spezifität eingesetzt: SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo- 1, Chromatin, Ribosome und M2. Zusätzlich wurden Proben getestet, die in der Immunfluoreszenz und im Western Blot positiv für Zentromer, p80-coilin, Nukleoli und PCNA waren. Aus dieser Studie ergibt sich für den ANA ELISA eine klinische Sensitivität von 93 % und eine klinische Spezifität von 91 %. Der Prozentsatz ANA positiver Proben stimmt gut mit dem in der Literatur angegebenen überein. 1-4 Es muss auch berücksichtigt werden, dass einige dieser Patienten mit Kortikosteroiden zum Zeitpunkt der Serumentnahme behandelt wurden und deshalb mit niedrigen Antikörpertitern zu rechnen ist. Die Patienten mit Sjögren- Syndrom und Sklerodermie waren als IFT positive ANA bekannt. Interessant ist die Anzahl biologisch falsch positiver Ergebnisse beim ANA ELISA in der Normalbevölkerung im Vergleich zur Positivrate bei der Immunfluoreszenz, die in der Literatur mit % angegeben wird (siehe Tabelle im folgenden Kapitel). 11,12 Präzision und Reproduzierbarkeit Intra-Assay: Die Daten zur Intra-Assay-Varianz wurden durch die Testung von fünf Proben mit dem QUANTA Lite ANA ELISA erstellt. Dazu wurden sie zwölfmal, jede auf einer Mikrotiterplatte gemessen. Die Daten wurden nachfolgend aufgeführt. Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Durchschnitt 31 U 51 U 54 U 144 U 172 U Standardabweichung 1,3 3,4 6,0 9,6 6,5 Variationskoeffizient 4 % 7 % 11 % 7 % 4 % Inter-Assay Die Daten zur Inter-Assay-Varianz wurden durch die Testung von 4 positiven Proben und einer negativen erstellt. Dazu wurden sie einmal am Tag an sechs aufeinanderfolgenden Tagen gemessen. Die Daten wurden nachfolgend aufgeführt. Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Durchschnitt 16 U 27 U 31 U 47 U 160 U Standardabweichung 1,6 2,4 2,2 5,1 22,6 Variationskoeffizient 10 % 9 % 7 % 11 % 14 % Referenzen 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24: (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44: (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25: (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105: (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40: (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17: (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122: (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4: (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25: (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40: (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2: (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42: (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 7

8 Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service DEU October 2009 Revision 6 8