Spleissen Dezember 2009 Elmar Schiebel, ZMBH

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Bärbel Amsel
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1 Spleissen Dezember 2009 Elmar Schiebel, ZMBH

2 Bis 1970s: Eine Gen besteht aus einem Stück doppelsträngiger DNA. Dieses einfache Bild wurde 1977 durch die Entdeckung von Richard J. Roberts (Cold Spring Harbor Laboratory) und Phillip A. Sharp (Massachusetts Institute of Technology) radikal revidiert. Sie fanden heraus, daß ein Gen nicht nur aus einem sondern aus mehreren DNA Fragmenten zusammengesetzt sein kann. Diese kodierenden DNA Fragmente (Exons) sind durch nicht-kodierende Abschnitte (Introns) getrennt. Press Release 11 October 1993 The Nobel Assembly at the Karolinska Institute has today decided to award the 1993 Nobel Prize in Physiology or Medicine jointly to Richard J. Roberts and Phillip A. Sharp for their discovery of "split genes".

3 Eines der Experimente von Roberts und Sharp: Analyse von DNA-mRNA Hybride mittels EM.

5 Spleißen... Die typische prä-mrna enthält wenige kleine Exons vor einem Hintergrund riesiger intronischer Bereiche. Das korrekte Zusammenfügen der Exons in der korrekten Reihenfolge erfordert eine aufwendige Maschinerie (das Spleißosom, über 50 Proteine, 5 RNAs!!!). mittlere Gengröße mittlere Zahl an Exonen pro Gen mittleres Exon Basenpaare Basenpaare 1 bis 178 Die Spleißreaktion muss auf das Nukleotid genau durchgeführt werden, da es sonst zu Verschiebungen im Leseraster kommen würde. Bei der Translation würde dann ein Protein mit völlig falscher Aminosäuresequenz entstehen. Daher sind die zu spleißenden Stellen auf der prä-mrna sehr genau markiert.

6 Punktmutationen (Austausch eines einzigen Nukleotids gegen ein anderes) an Spleißgrenzen sind sehr häufig die Ursache von Erbkrankheiten (15% aller genetisch bedingten Krankheiten). Ein Defekt der Spleißreaktion verursacht die Krankheit Beta-Thallasämiie. Ein normales beta-globin Gen ist bei der Person A vorhanden. B, C sind zwei mutierte Gene, die Beta-Thallasämiie verursachen. Die Pfeile zeigen die Position der Spleißmutationen an. Die gestrichelten Linien verbinden die Segmente, die durch die Spleißreaktion verbunden werden.

7 Wozu mag das Spleißen gut sein? 1) Evolutionäre Argumentation: Exons kodieren Protein-Domänen, welche im Baukastenprinzip zu neuen Proteinen rekombiniert werden können. 2) Das Codierungspotential des Genoms wird durch alternatives Spleißen stark erhöht -- ein Gen kann verschiedene Genprodukte codieren.

8 Pyruvate Kinase, ein Protein bestehend aus drei Domänen.

9 Alternatives Spleißen...

10 Gewebeabhängiges alternatives Spleißen des Tropomyosin-Gens

11 Sequenzmerkmale an Intron-Exon-Grenzen (Säugetierzellen): Drei Stellen müssen für den Spleißvorgang markiert sein: Spleißstelle 2. Verzweigungsstelle Spleißstelle Knippers, Abb 14.1 Nur die Folge GU am Anfang und AG am Ende des Introns sind invariant, alle anderen Elemente des Konsensus können im Einzelfall abweichen. Das macht die genaue Vorhersage der Spleißstellen sehr schwierig (für einen Wissenschaftler! -- die Zelle weis bescheid...).

12 Basierend auf den Sequenzdaten von genomischer DNA, ist es häufig schwierig ein Gen zu identifizieren. Dies ist jedoch äußerst wichtig, bedenkt man, dass in der Zwischenzeit sehr viele Genome sequenziert sind. Wissenschaftler haben deshalb Computerprogramme entwickelt, die es erlauben Genen vorherzusagen. Diese machen Vorhersagen für lange Offene Leserahmen (ORFs), Promotoren, Intron/Exon Spleißstellen, und Polyadenylierungs-Stellen. GENSCAN Dieses Computerprogramm erlaubt es Intron/Exon Spleißstellen, Promotoren und Polyadenylierungs Sequenzen vorherzusagen. Es verbindet zudem die verschiedenen Exons, um ein langes translatiertes Protein zu erzeugen, das wiederum dazu benutzt wird, um eine Protein-Datanbanken zu durchsuchen (interne Kontrolle). Simply paste the genomic DNA sequence you wish to analyze into the box labeled DNA sequence and select Run GENSCAN.

13 Die Chemie des Spleißens ist einfach: Während des Spleißens laufen zwei Transester-Reaktionen ab. 1) Die Phosphodiester-Verknüpfung am 5 -Ende des Introns wird gelöst und gleichzeitig bildet sich eine ungewöhnliche 2 -> 5 Phosphodiester-Verknüpfung am Verzweigungspunkt. Das in sich vernetzte Zwischenprodukt wird auch als Lariat*-Zwischenform bezeichnet. Das nun freie 3 -Ende des vor dem Intron liegenden Exons greift die Phosphodiester-Verknüpfung am 3 -Ende des Introns an. 2) Eine normale 5 -> 3 Phosphodiester-Verknüpfung verbindet nun die beiden Exons miteinander. Das Intron wird als Lariat freigesetzt. Die Chemie der Spleiß-Reaktion benötigt keine Energie-Zufuhr in Form von ATP- oder GTP-Hydrolyse. Trotzdem läuft das Spleißen unter hohem Energieverbrauch ab, was die ungeheure Präzision ermöglicht. * Lariat ist ein ungewöhnliches Wort für Lasso.

14 Der Zwei-Schritt-Prozess: Verzweigungsstelle Exon 1 5 Exon 2 Exon 1 3 Exon 2 Exon 1 5 Exon 1 5 Intron Exon 2 3 Knippers, Abb 14.2

15 Intron Die Lariat-Zwischenform: Ungewöhnlich ist die Verzweigung eines Polynukleotids, die auf einer Phosphodiester-Bindung an der 3 - und der 2 -OH-Gruppe eines Ribose- Bausteins beruht. Exon 2 Verzweigungsstelle Knippers, Abb 14.3

16 Der Zwei-Schritt-Prozess (noch mal!): 3 Spleißstelle 5 Spleißstelle

17 TGGE: Temperature gradient gel electrophoresis erlaubt den Nachweis von Lariat Strukturen 20ºC 60ºC

18 Die Chemie des Spleißens ist einfach,... der Gesamtprozess hochkomplex: Das Kunststück besteht darin, die Exon-Intron-Grenzen richtig zu erkennen und die beiden Transester-Reaktionen an der richtigen Stelle zu katalysieren. Dieses Kunstück vollbringt eine zelluläre Maschine, die das Spleißosom genannt wird. Die eigentliche Erkennung der relevanten Stellen wird von kleinen RNA-Molekülen durchgeführt. Die heißen snrnas (small nuclear RNAs). Sie sind mit vielen Proteinen assoziiert; diese RNA-Protein- Komplexe nennt man snrnps (small ribonucleoprotein, Snurps!). Der wichtige Punkt: Während der Spleißreaktion werden diese kleinen RNAs benutzt, um wiederholt die Sequenz an den bearbeiteten Stellen nachzuprüfen (d.h. nur wenn sie sich entsprechend mit der bearbeiteten Stelle paaren können, läuft die Reaktion weiter). Weiterhin bilden sie das katalytische Zentrum des Spleißosoms.

19 Die an der Spleißreaktion beteiligten snrnas: Knippers, Tab 14.1

20 snrnp Die beiden essentiellen Komponenten von snrnps sind Proteinmoleküle (RNP) und RNA. Der RNA Anteil wird auch als small nuclear RNA oder snrna bezeichnet. snrnas sind ungefähr 150 Nukleotide lang. snrna hat eine direkte und strukturelle Rolle. Struktur der U2 snrnp

21 U5 8 U2 6 U2 Das Spleißen von RNA wird durch ein dynamisches Assemble von snrnps katalysiert, die zusammen mit weiteren Proteinen das Spleißosom bilden. Das Spleißosom erkennt die Spleißsignale auf einem der prämrna Molekül, führt die beiden Enden des Introns zusammmen und stellt die enzymatische Aktivität für die beiden Transester-Reaktionen. 1. BBP (branch point binding protein) + U2AF erkennen den Branch point. 2. BBP/U2AF werden durch U2-snRNP ersetzt. 3. U1-snRNP bindet an 5 Spleißstelle. 4. U4/U6+U5 binden. 5. Umlagerung: U4 löst sich. U6 verdängt U1 von der 5 Spleißstelle. 6. Transester-Reationen laufen ab. 7. Fusion von Exon 1-Exon 2 8. Freisetzung von Lariot, U2-U5-U6.

22 Umlagerungen im Spleißosom Schritt 5: U6 bindet an die 5 Spleißstelle und interagiert mit U2. Erste Transester-Reaktion. Schritt 6: Freigesetztes 5 Exon 1 interagiert mit U5. Umlagerung von Exon 2. Zweite Transester-Reaktion.

23 Ein Großteil der beim Spleißen verbrauchten Energie (in Form von ATP-Hydrolyse) fließt in die Aktivität von RNA-Helikasen. Diese trennen die RNA-Doppelstränge, die für die Erkennung der relevanten Sequenzen auf dem Substrat und beim Aufbau des katalytischen Zentrums gebildet werden.

24 Wir erinnern uns noch mal, dass das Spleißen schon während der Transkription an der entstehenden prä-mrna beginnt! Pollard, Earnshaw Im Rückblick wird klar, dass alternatives Spleißen auf einer zelltypspezifischen Regulation der Spleiß-Reaktion beruhen muss (die Details sparen wir uns für später...).

26 Herstellung von cdna: Das polya-ende von mrnas kann für die selektive Anreicherung dieser (seltenen) RNA-Spezies genutzt werden. Ein oligo-dt-primer kann dann benutzt werden, um die RNA mit der reversen Transkriptase in cdna umzuschreiben. Der anschliessende RNaseH-Verdau hinterlässt RNA-Fragmente, die wiederum als Primer für die Zweitstrangsynthese dienen und im Verlauf der DNA-Synthese abgebaut werden. Jetzt liegt eine doppelsträngige cdna vor.

27 Eine Gen-Bibliothek ist eine (zufällige) Mischung von DNA- Fragmenten, die in einen Vektor kloniert sind. Der Vektor kann ein Plasmid oder ein Bakteriophagen-Derivat (wie z.b. M13) sein, oder Elemente von beiden enthalten ("Phagemid"). Eine gute genomische Biobliothek sollte die gesamte genetische Information eines Organismus umfassen.

28 Genomische DNA Bibliothek

29 Zwei verschiedene Typen von Genbibliothek im Vergleich: Genomische DNA Bibliothek cdna Gen-Bibliothek Wann sinvoll? Vorteile? Nachteile?

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