PCR (polymerase chain reaction)

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1 PCR (polymerase chain reaction) Ist ein in vitro Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen (genomische DNA, cdna (c complementary)..) 1

2 PCR-History Erfunden 1983 von Dr. Kary Mulles Er erhielt 10 Jahre später den Nobelpreis für Chemie Seit 1992 tausende Zitate in Publikationen PCR hat extrem viele Anwendungsgebiete (Vaterschaftstest, Gerichtsmedizin, Krankheitsnachweise..) 2

3 Einsatzmöglichkeiten der PCR Amplifikation von DNA Bereichen cdna-klonierung und cdna-genbanken DNA-Foot- & Fingerprinting DNA-Sequenzierung Gen-Diagnostik (genetische Erkrankungen) Isolierung von DNA-Fragmenten Markierung von DNA-Fragmenten Mutagenisierung von DNA-Fragmenten 3

4 Prinzip PCR Welche Nukleinsäuresequenz soll amplifiziert werden? Welche DNA wird als Vorlage-Template verwendet (Genomische, cdna ) Primer setzen und suchen (Kriterien) Temperaturprogramm wählen DNA aus PCR Gemisch isolieren Weiterverwendung der isolierten DNA 4

5 Primer setzen und suchen Primer im Randbereich der zu amplifizierenden Sequenz setzen (5-3 Amplifikation) Komplementär zu je einem Strang Mit oder ohne Startcodon/Stopcodon Wie lang sollen die Primer sein Schmelztemperatur berücksichtigen Verhältnis G:C zu A:T beachten!! Sollen neue Schnittstellen kreiert werden? 5

6 PCR-Gemisch Template DNA (100 ng cdna, 500 ng genomische DNA) Primer (10 µmolar) DNA-Polymerase Taq (Bakt Thermus aquaticus) dntps (Nukleosidtriphosphate) PCR-Puffer dd H2O MgCl2 / DMSO (optional) 6

7 Temperatur- und Zeitprogramm Denaturieren zum Einzelstrang (94 C, 30 sec) Anhybridisieren der Primer (Annealing, 30 sec) kommt auf die Schmelztemperatur der Primer an umso höher die Temperatur umso spezifischer das PCR-Produkt Amplifizieren mittels DNA-Polymersase (72 C, 2-4 min) kommt auf Größe des Produkts an!! mittels hitzestabiler Taq-Polymerase (proof reading oder nicht?) 7

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9 Kontrolle und Isolierung der DNA aus PCR Gemisch Wie groß ist das erwartete PCR-Produkt? Welches Agarosegel verwendet man (meist 0,7-2%)? Ist nur ein Produkt sichtbar oder mehrere? bei vielen Banden muß PCR nochmal und spezifischer gemacht werden Ausschneiden der Spezifischen DNA-Bande aus dem Gel Isolieren der DNA aus dem Gelstückchen (Kit) Weiterverarbeitung der DNA (NB, Klonierung, etc) 9

10 Laufrichtung DNA auf Agarosegel 10

11 Molekulare Diagnostik Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches 11

12 Agarosegel zur Auftrennung des PCR-Gemisches 12

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