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1 I... I Abbildungs- und Tabellenverzeichnis... VI Abkürzungsverzeichnis... IX 1 Einleitung Untersuchte uro-rektale Fehlbildungen Blasenekstrophie-Epispadie-Komplex (BEEK) Isolierte Epispadie (E) Klassische Blasenekstrophie (KBE) Kloakenekstrophie (KE) Embryologie des BEEK Epidemiologie des BEEK Genetik des BEEK Anorektale Malformationen (ARM) VATER/VACTERL-Assoziation Prune-Belly-Syndrom (PBS) Embryologie der ARM Epidemiologie der ARM Genetik der ARM allgemein Systematische Identifizierung von kausalen Genen und Regionen bei seltenen angeborenen uro-rektalen Fehlbildungen Untersuchungen zu ursächlichen Kopienzahlveränderungen (CNV- Analysen) Next Generation Sequencing (NGS) Netzwerk für kongenitale uro-rektale Fehlbildungen (CURE-Net) Zielsetzung Material und Methoden... 24

2 II 3.1 Verwendete Materialien Geräte Chemikalien und Enzyme Lösungen Kommerzielle Systeme (Kits) Software und Datenbanken Molekularbiologische Untersuchungen Isolierung genomischer DNA und RNA Konzentrations- und Reinheitsmessung Fällung von verunreinigter DNA Genomweite SNP-Array Genotypisierung mit Illumina Multiplex ligations-abhängige Sondenamplifikation (MLPA) Auswahl der Oligonukleotidsequenzen (Primer-Design) DNA-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion; PCR) PCR-Reaktionsansätze PCR-Reaktionsbedingungen Agarose-Gelelektrophorese Quantitative PCR (qpcr) qpcr-reaktionsansatz und-bedingungen Schmelzkurve Auswertung ΔΔCt-Methode Automatisierte Sanger-Sequenzierung Probenvorbereitung und Primer für die Sanger-Sequenzierung Sanger-Sequenzierungsansatz und -Reaktionsbedingungen Vorbereitung, Auftrennung und Verarbeitung der Sequenzierfragmente Next Generation Sequencing (NGS) Roche 454 GenomeSequencer FLX (GS-FLX) Titanium Instrument Illumina (Solexa) Genome Analyzer (GA) Applied Biosystems (ABI) SOLiD System Ganzpräparat in situ Hybridization (WISH)... 47

3 III Powerplex 16-System zur Bestätigung der Elternschaft Auswahl der Verifikationsmethoden Bioinformatische und statistische Methoden GenomeStudio (GS) B-Allel Frequenz (BAF) Log-R-Ratio (LRR) CNV Detektion in GS Ermittlung der Abstammung in GS Genomweite Detektion von CNVs mittels QuantiSNP Einschätzung der biologischen Relevanz von CNVs Nicht öffentlich zugängliche interne Kontrollkollektive Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources (DECIPHER) Database of Genomic Variants (DGV) University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser Mouse Genome Informatics (MGI) Datenbank Cartagenia Bench Sofware (Cartagenia) Auswertung und computerbasierte Analyse der NGS Daten Prädiktionsprogramm (PS) 2 -v2 zur Vorhersage der Proteinstruktur Prädiktionsprogramme zur Interpretation detektierter Varianten Durchführung der Analysen Filterkriterien für die CNV-Analyse Ergebnisse Genetische Untersuchungen bei Patienten mit Blasenekstrophie-Epispadie- Komplex (BEEK) Analysen der Kopienzahlveränderungen bei BEEK Duplikationen auf Chromosom Duplikation auf Chromosom CNV-Analyse in acht konsanguinen iranischen Familien... 70

4 IV Sequenzierungsanalysen NGS Analysen bei Duplikationen auf Chromosom NGS Analyse einer konsanguinen marokkanischen Familie Kandidatengenanalyse für CYR Kandidatengenanalyse für WIZ Kandidatengenanalyse für SNAP29 und CRKL Genetische Untersuchungen bei Patienten mit isolierter anorektaler Malformation (ARM) Analysen der Kopienzahlveränderungen bei ARM Duplikation auf Chromosom Deletion 18q-Syndrom Kandidatengenanalyse für ausgewählte Gene der WNT- und FGF- Signalwege Genetische Untersuchungen bei Patienten mit VATER/VACTERL-Assoziation Genetische Untersuchungen bei Patienten mit Prune-Belly-Syndrom (PBS) Diskussion Blasenekstrophie-Epispadie-Komplex (BEEK) Duplikation auf Chromosom Duplikation auf Chromosom 19 und WIZ als Kandidatengen ALDH1A2 (CNV Analyse in acht iranischen konsanguinen Familien) NGS-Analyse einer konsanguinen marokkanischen Familie (TTLL3) Kandidatengenanalyse für CYR Isolierte anorektale Malformation (ARM) Duplikation auf Chromosom Deletion-18q-Syndrom Ausgewählte Kandidatengene der WNT- und FGF-Signalwege VATER/VACTERL-Assoziation Prune-Belly-Syndrom (PBS)...111

5 V 6 Zusammenfassung Ausblick Literaturverzeichnis Eigene Publikationen Anhang Danksagung Eidesstattliche Versicherung...162

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