Informationsveranstaltung Heimtierfuttermittel. PCR-Analytik zur Bestimmung von GVOs in Heimtierfuttermitteln. C. Haldemann, ALP

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1 Informationsveranstaltung Heimtierfuttermittel PCR-Analytik zur Bestimmung von GVOs in Heimtierfuttermitteln C. Haldemann, ALP

2 Grundidee des Nachweises von GVOs mittels PCR Die Bestimmung genveränderter Organismen (GVO) basiert auf dem Nachweis von ampilifzierter Deoxyribonukleinsäure (DNA), die zielgerichtet in das Genom eines Organismus eingebracht wurde, um dem Organismus eine neue Eigenschaft zu verleihen (z.b. Toleranz gegen Schädlinge, Herbizide etc).

3 Struktur der DNA Helix Umdrehung = 3.4nm Zucker - Phosphat Gerüst Base Wasserstoff-Verbindungen

4 Schematisch dargestelltes Gen Konstrukt eines GVO: Promotor Gen Enhancer (Expressionsregulator) Terminator Ziel: Einfügen in Wirt-DNA Erfolgreiche Transformation

5 DNA-Eigenschaft als Voraussetzung der PCR: DNA Denaturierung und Hybridisierung Doppel-Strang DNA Erhitzen Denaturierung Einzel-Strang DNA Abkühlen Re-Naturierung Hybridisierung Doppel-Strang DNA

6 Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase-Kettenreaktion Zyklen 94 Temperatur (ºC) Denaturierung primer Anbindung Extension Reaktions Mix: - DNA Vorlage -dntps -MgCl 2 -primer - DNA polymerase Zeit (min.)

7 Exponentielle DNA-Amplifikation

8 Quantitative real-time PCR TaqMan System TaqMan Sonde Primer 5 3 reporter quencher Taq 3 5 FLUORESCENCE 5 3 Taq 3 5 Reporter = FAM, VIC Quencher = TAMRA

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10 Arbeitsschritte zur Bestimmung von GVOs mittels PCR 1. Probenaufbereitung 2. DNA Extraktion 3. Zubereitung des PCR Mastermix

11 qualitative end-punkt PCR quantitative real-time PCR 4. Amplifikation 5. Daten Analyse Resultat: (nicht) nachweisbar Resultat: z.b. in % GVO

12 PCR Kontrollen Positiv Kontrolle (Probe mit der zu untersuchenden Ziel-Substanz) Negativ Kontrolle (Probe ohne die zu untersuchende Ziel-Substanz) Extraktions Kontrolle (Kontrolle der Reinheit des DNA Isolierungs Proesses) PCR Kontrolle oder No Template Control (NTC) (Kontrolle für Reinheit der Reaktionskomponenten Quantitative Kontrolle (Probe mit bekannter Konzentration der zu untersuchenden Ziel-Substanz) Zieltaxonspezifisches Gen Kontrolle eine zweite Ziel-Substanz, vorhanden in allen zu untersuchenden Proben (z.b. Lektin für Soja)

13 Sicherheitsvorkehrungen um Kontaminationen zu verhindern Räumlich getrennte GVO Laboratorien UV-Bestrahlung während der Nacht Mastermix versehen mit Uracil-DNA Glycosylase (UNG) and dutp anstelle von dttp Probenzerkleinerungsgeräte mit Sodiumhypochlorid (Javel-Wasser) dekontaminieren Tragen von Handschuhen Benutzen von Einweg-Plastikwaren von Einweg- Plastikwaren und Pipettenspitze mit Aerosol-Barriere

14 Qualitäts Kontrolle in der GVO Analytik Unsere GVO-Laboratorien sind akkrediert nach: ISO 9001:2000 / ISO Alle Methoden müssen eine hausinterne Validierung bestehen bevor sie zum routinemässigen Einsatz gelangen Aktive Teilnahme an verschiedenen Proficiency Tests (PT), wie: ISTA PT on GMO testing GeMMA PT (Genetically Modified Material Analysis Scheme) Bipea (Bureau Interprofessionnel d Etudes Analytiques) etc.

15 Vielen Dank um Ihre Aufmerksamkeit