Lebensmittelanalytisches Praktikum für Ernährungswissenschaftler

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1 1 Lebensmittelanalytisches Praktikum für Ernährungswissenschaftler NACHWEIS DER ART DER WÄRMEBEHANDLUNG VN MILCH I. Einleitung Zum Nachweis der erfolgreichen Wärmebehandlung von Milch wird routinemäßig die Enzymaktivität von zwei unterschiedlich hitzestabilen Enzymen, nämlich der Phosphatase bzw. der Peroxidase herangezogen. 1. Behandlung der Milch im Verarbeitungsbetrieb Nach dem Melken wird die Milch auf 4-5 C abgekühlt. In der Molkerei wird sie zunächst zentrifugiert, um Staubpartikeln, eventuell einen Teil der Bakterien, sowie einen Teil des Milchrahms zu entfernen. Daran schließt eine Wärmebehandlung an Pasteurisieren: a) Dauererhitzen (62 65 C, min) oder Kurzzeiterhitzen (72 75 C, sec): Phosphatase-Nachweis negativ, Peroxidase-Nachweis positiv. b) Hocherhitzen (mindestens 85 C, mindestens 4 sec): Phosphatase- und Peroxidase- Nachweis negativ Ultrahocherhitzen Ultrahocherhitzen (UHT): C, 1 sec und Abfüllen unter aseptischen Bedingungen in sterile, lichtgeschützte Packungen. Diese H-Milch ist sechs Wochen ohne Kühlung haltbar Sterilisieren Die Milch wird in verschlossenen Behältnissen bei C, min sterilisiert (Vollkonserve). Wird die Milch vor der Hitzebehandlung bei C mit Unterdruck eingedickt, so kommt sie als Kondensmilch in den Handel Kochen: Erhitzen der Milch bis zum wiederholten Aufkochen Thermisieren: + 57 bis + 68 C mit einer Heißhaltezeit von längstens 30 sec; nach der Thermisierung muss der Phosphatasenachweis positiv sein. Ziel: größtmögliche Verringerung der Keimzahl bei möglichst schonender Behandlung ESL (extended shelf life)-milch: Kombination von Pasteurisation, Bactofugation und Mikrofiltration; Ziel: länger haltbare Milch mit den sensorischen Eigenschaften kurzzeit-pasteurisierter Milch.

2 2 2. Ziele der Wärmebehandlung - Abtötung von Krankheitserregern, u.a. Salmonellen, Listerien, Tbc und Coliformen - Abtötung von Bakteriensporen - Erhöhung der Haltbarkeit der Milch - bei Vermeidung von Kochgeschmack und anderen organoleptischen Beeinträchtigungen - und Erhalt wertvoller Inhaltsstoffe (Vitamine, Lysin,...) 3. Indikatoren, die zur Beurteilung der Wärmebehandlung von Milch herangezogen werden können Typ 1: Verbindungen, die denaturiert bzw. inaktiviert werden (Proteine): - Alkalische Phosphatase: Unterscheidung zwischen pasteurisierter und Rohmilch (bzw. thermisierter Milch) - Lactoperoxidase: Unterscheidung zwischen Hocherhitzen ("highly pasteurized") und Kurzzeit- bzw. Dauererhitzen - Whey protein nitrogen index (WPNI): nichtdenaturierte Molkenproteine sind löslich in gesättigter NaCl-Lösung, Unterscheidung zwischen pasteurisierter und UHT-Milch möglich. - Säurelösliches β-lactoglobulin: Unterscheidung zwischen pasteurisierter und UHT-Milch

3 3 Typ 2: Verbindungen, die durch Reaktion oder Abbau entstehen: - Lactulose: 4--β-D-Galactopyranosyl-D-Fructose, entsteht durch Isomerisierung von Lactose (Unterscheidung zwischen pasteurisierter, UHT- und sterilisierter Milch) - Hydroxymethylfurfural (HMF): aus Hexosen, Indikator für Hocherhitzung und UHT - Furosin: Produkt der Maillard-Reaktion eines reduzierenden Zuckers mit Lysin. Ein erhöhtes Verhältnis Furosin : Lactulose kann Zugabe von Milchpulver zu pasteurisierter oder UHT-Milch anzeigen. II. Aufgabenstellung Anwesenheit oder Abwesenheit von Phosphatase und Lactoperoxidase sollen festgestellt werden. Aufgrund dieses Ergebnisses soll die Art der Erhitzung geschlossen werden. III. Untersuchung der Milch 1. Phosphatase-Test nach Kiermeier und Meinl (Nachweis der Kurzzeit- und Dauererhitzung der Milch) Prinzip: Rohmilch enthält das Enzym alkalische Phosphatase (EC ), welches bei ordnungsgemäßer Kurzzeit- bzw. Dauererhitzung irreversibel inaktiviert wird. Der Test weist noch vorhandene Enzymaktivität der Phosphatase in der Milch nach: Dinatriumphenylphosphat als Substrat wird durch Phosphatase gespalten und das freigesetzte Phenol wird durch eine Farbreaktion zu einem blauen Indophenol-Farbstoff nachgewiesen. P Phosphatase H + + H 2 H P

4 4 H + Cl N - HCl H N N H Indophenol-Farbstoff (blau) Durchführung des Phosphatase-Tests: In ein Reagensglas werden 10 ml der frisch bereiteten Dinatriumphenylphosphatlösung pipettiert. Diese Lösung wird im Wasserbad auf ca. 38 C erwärmt. Nach Erreichen der gewünschten Temperatur setzt man 1 ml der zu prüfenden Milch zu und vermischt die beiden gut. Zur Herstellung einer Kontrollprobe benutzt man eine durch Erhitzen auf 85 C phosphatasefrei gemachte und wieder abgekühlte Milch, die ebenso behandelt wird wie oben beschrieben. Sodann werden beide Reagensgläser in einem Wasserbad bei 38 C belassen (15 Minuten für qualitative Auswertung). Danach wird den Proben je 0.5 ml des Farbreagens zugesetzt, durchgemischt und weitere 10 Minuten im Wasserbad bei 38 C stehen gelassen. Dann wird die Probe nochmals gut durchgeschüttelt. Die erhaltenen Farbtöne werden nach weiteren 3-5 Minuten miteinander verglichen. Die Kontrollprobe soll eine rötlichbraune Färbung besitzen, die allmählich in grau übergeht. Schwach positive Proben zeigen blaugraue Farbtöne. Bei positiver Reaktion erscheint eindeutig eine blaue Färbung. Die Methode erfasst einen Rohmilchzusatz von 0.3% zu erhitzter Milch. Bei Kurzzeiterhitzung kann ein Unterschreiten der erforderlichen Erhitzungstemperatur von 71 C um 2 C schwach und um 3 C mit Sicherheit erkannt werden. Bei Dauerhitzung ist bereits ein Unterschreiten der geforderten Mindesterhitzungstemperatur von 63 C um 2 C mit Sicherheit nachweisbar. Chemikalien und Geräte: Reagensgläser (mind. 15 ml) 0.5 ml, 1 ml, 10 ml Vollpipetten 2 x 500 ml Messkolben 1 x 100 ml Messkolben 1 x 50 ml Messkolben NaHC 3 Na 2 C 3 wasserfrei Dinatriumphenylphosphat 2,6-Dibromchinon-4-chlorimid 96% Ethylalkohol

5 5 Herstellung der Lösungen: Puffergemisch: In je einen 500 ml Messkolben werden 5 g NaHC 3 und 5 g Na 2 C 3 wasserfrei eingewogen und in dest. Wasser gelöst. Nach dem vollständigen Auflösen vermischt man 75 ml der Bicarbonatlösung mit 50 ml der Carbonatlösung (das Puffergemisch soll einen ph von 9.5 haben). Dinatriumphenylphosphatlösung: 0.1 g Dinatriumphenylphosphat werden in einen 100 ml Messkolben eingewogen und mit Puffergemisch bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung muss vor Reaktionsbeginn frisch bereitet werden. Farbreagens: 0.05 g 2,6-Dibromchinon-4-chlorimid werden in einem 50 ml Messkolben in 96% Ethylalkohol gelöst. Auch diese Lösung ist nur wenige Tage im Kühlschrank haltbar. 2. Bestimmung der Peroxidase-Aktivität in Milch (Nachweis der Hocherhitzung) 2.1. Zweck und Anwendungsbereich Die Arbeitsvorschrift beschreibt das Referenzverfahren zur Bestimmung der Anwesenheit bzw. Abwesenheit des Enzyms Lactoperoxidase in der Milch für den einwandfreien Pasteurisierungsnachweis (Hocherhitzen) Prinzip Lactoperoxidase (EC ) ist ein 78 kda-glykoprotein mit Protohäm IX als prostethischer Gruppe. Sie katalysiert den Abbau von Wasserstoffperoxid. Der dabei freigesetzte atomare Sauerstoff oxydiert eine farblose 1,4-Phenylendiamin-Lösung zu violettem Indoamin (Storchsche Reaktion). Die Intensität der Färbung ist proportional zur Enzymkonzentration. Positive Peroxidasereaktion: 30 Sekunden nach dem Durchmischen färbt sich vorschriftsmäßig pasteurisierte Milch blau. Negative Peroxidasereaktion: 30 Sekunden nach dem Durchmischen kein Farbumschlag Durchführung - 5 ml der Milchprobe werden in ein sauberes Probenröhrchen mit geeignetem Verschluss gegeben. - 5 ml der 1,4-Phenylendiamin-Lösung werden zugegeben. - Ferner werden zwei Tropfen Wasserstoffperoxid-Lösung zugegeben. - Auf den 30 Sekunden nach dem Durchmischen auftretenden Farbumschlag ist zu achten. Ein später als 30 Sekunden nach dem Zusatz der Reagenzien auftretender Farbumschlag ist eine unspezifische Reaktion.

6 Reagenzien und Geräte Probenröhrchen mit Verschluss (mind. 15 ml) 5 ml, 10 ml Vollpipette 5 ml Messpipette 2 x 100 ml Messkolben Dunkelbraune Flasche 1,4-Phenylendiamin Schwefelsäure konz. 30%iges Wasserstoffperoxid Herstellung der Lösungen 1,4-Phenylendiamin-Lösung 2 g 1,4-Phenylendiamin ( C 6 H 8 N 2 ) werden im warmen Wasser (50 C) gelöst und auf 100 ml aufgefüllt. Die Lösung wird in einer dunkelbraunen Flasche mit Glasstopfen kühl und dunkel aufbewahrt. Die 1,4-Phenylendiamin-Lösung bildet innerhalb von 1 bis 2 Tagen nach dem Ansetzen einen Niederschlag, der zu entfernen ist. Wasserstoffperoxid-Lösung 9 ml Wasserstoffperoxid mit einem Massenanteil von ca. 30% werden in Wasser gelöst und auf 100 ml aufgefüllt. Zur Stabilisierung wird 1 ml konzentrierte Schwefelsäure je Liter Lösung zugegeben. Die Wasserstoffperoxid-Lösung ist einen Monat lang haltbar, sofern sie in einer Flasche mit Glasstopfen als Schutz gegen organische Verbindungen im Dunkeln aufbewahrt wird. IV. Abzugeben Analysenprotokoll Anwesenheit oder Abwesenheit der Enzyme Art der Erhitzung der Probe