Einarbeitung und Validierung der Methode zur Bestimmung von Molkenproteinen in Speisequark mittels eines neuen Spektrometers

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1 Thüringer Landesanstalt für Landwirtschaft Molkenproteine in Speisequark (Zwischenbericht) Einarbeitung und Validierung der Methode zur Bestimmung von Molkenproteinen in Speisequark mittels eines neuen Spektrometers Themenblatt-Nr.: /2004 Das Thüringer Ministerium für Landwirtschaft, Naturschutz und Umwelt

2 Themen Nr.: / Zwischenbericht Molkenproteine in Speisequark Einarbeitung und Validierung der Methode zur Bestimmung von Molkenproteinen in Speisequark mittels eines neuen Spektrometers Zielsetzung: - Verbesserung der Qualität der Analyse durch ein qualitativ höherwertiges Spektrometer und durch Nutzung der erweiterten Möglichkeiten der Optimierung der Auswertung mittels Derivativspektroskopie. - Reduzierung des Arbeitszeitaufwandes für die Bestimmung der Molkenproteine durch die mögliche Automatisierung der Spektrenaufnahme und vereinfachte Arbeitsabläufe bei der Auswertung. - Flexibilisierung des Arbeitsablaufes und damit Verkürzung der Bearbeitungszeit der Proben. Molkenproteine im Quark Wird zur Herstellung von Quark oder Käse Milch angesäuert oder mit Lab versetzt, so fällt eine Gallerte aus. Sie enthält den Teil des Eiweißes, der als Casein bezeichnet wird. In der Molke zurück bleiben die Eiweiße, die als Molkenproteine bezeichnet werden. Zur Herstellung von Quark oder Käse erfolgt eine mechanische Abtrennung dieser Gallerte, des Frischkäses. Diese Abtrennung ist nicht vollständig. Mit der restlichen Molke verbleibt im Frischkäse auch ein Teil der Molkenproteine. Ihr Anteil hängt von den Arbeitsbedingungen und diese hängen von den beabsichtigten Produktzielen ab. Er liegt bei traditionell hergestelltem Quark in der Größenordnung von 6 % Molkenproteine am Gesamteiweiß. Durch das Thermoquarkverfahren, das in den siebziger Jahren entwickelt wurde, konnte durch eine Zweiterhitzung (nach der vorgeschriebenen Pasteurisierung der Milch vor der Verarbeitung zu Quark) eine dauerhafte Bindung von Molkenprotein an das Casein erreicht werden. Das hat mehrere Vorteile: Die Ausbeute an Quark kann erhöht werden und hat dadurch einen wirtschaftlichen Vorteil. Molkenproteine haben einen hydrophilen Charakter, der die Bindung von Wasser im Quark verbessert und neben einer Verringerung der Molkenlässigkeit auch die Konsistenz, insbesondere die Geschmeidigkeit, und damit die Qualität und die Akzeptanz beim Verbraucher verbessert. Für die menschliche Ernährung sind die Molkenproteine wertvoll, weil sie vom menschlichen Organismus leicht zu verarbeiten sind, eine biologische Wertigkeit von nahezu 100 aufweisen und mehr essentielle Aminosäuren enthalten als die Caseine. Durch die technologische Realisierung der Ultrafiltration in der Milchindustrie zur Anreicherung der Molkenproteine in der Molke wurde es allgemein möglich, das Verhältnis Molkenprotein zu Casein weiter zu erhöhen, ohne den Wassergehalt, der laut

3 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.2 von 12 Käseverordnung in Abhängigkeit vom Fettgehalt vorgegeben ist, mit ansteigen zu lassen. Vom Gesetzgeber wurde der Einsatz von UF-Vollkonzentraten, später auch der Zusatz von Molkeretentaten zu der Standardsorte Quark in der Käseverordnung erlaubt. Der Anteil der Molkenproteine am Gesamteiweiß wurde mit 18,5 % limitiert, was mit einer großzügigen Toleranz den Verhältnissen in der Rohmilch entspricht. Um dem Verbraucher die Sicherheit beim Kauf von Speisequark als Standardsorte zu geben, ist es notwendig, auch den Anteil der Molkenproteine am Gesamteiweiß zu überprüfen. Bestimmungsmethoden des Anteils der Molkenproteine im Gesamteiweiß Die Caseine und auch die Molkenproteine sind jeweils ein Gemisch aus mehreren Proteinen. Insgesamt werden in der Milch etwa 28 verschiedene Proteine in meßbaren Mengen gefunden. Um sie entweder den Caseinen oder den Molkenproteinen zuzuordnen und analytisch voneinander zu trennen, müssen die beiden Gruppen Eigenschaften haben, die sie zur jeweiligen Gruppe gehörig charakterisieren und von der anderen Gruppe abheben. Die direkte Bestimmung Nach der Definition gehören diejenigen Proteine zu den Caseinen, die bei Ansäuerung ausfallen. Wenn man unter Beachtung des isoelektrischen Punktes der Caseine von ph = 4,6 eine vollständige Ausfällung der Caseine vornimmt, kann man den Eiweißgehalt der Caseine in dem ursprünglichen Milchprodukt, z.b. dem Quark, vornehmen. Bestimmt man dann den gesamten Eiweißgehalt in diesem Produkt, läßt sich daraus das Verhältnis ermitteln. Das Verfahren setzt eine exakte und Routine erfordernde Arbeitsweise voraus und ist sehr arbeitsaufwendig. Sie wird deshalb im allgemeinen Laborbetrieb nicht eingesetzt. Die Casein-Phosphor-Methode Sie nutzt die Tatsache, daß nur an den Caseinen Phosphor in Form von Phosphorsäure gebunden ist. Im Molkenprotein ist kein Phosphor gebunden. Der Molkenproteinanteil läßt sich also durch Bestimmung des Gesamteiweißes und eine Phosphorbestimmung ermitteln. Auch diese Methode ist arbeitsaufwendig und erfordert große Sorgfalt, weil geringe Unrichtigkeiten große Fehler verursachen. Die Casein-Phosphor-Methode ist als amtliche Methode nach 35 LMBG L beschrieben und dort u.a. Speisequark als Anwendungsgebiet benannt. Die polarographische Methode Diese Methode beruht darauf, daß in den Molkenproteinen deutlich mehr Cystin und Cystein enthalten ist als im Casein. Die Polarographie ist eine elektrochemische Methode. Sie hat den Vorteil, daß der Aufwand zur Probenvorbereitung relativ gering ist und auch die eigentliche Messung kein Problem ist. Leider läßt sich dabei der Um-

4 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.3 von 12 gang mit flüssigem Quecksilber nicht vermeiden. Aus Arbeitsschutzgründen wird deshalb die Polarographie immer weniger eingesetzt. Die Polarogrphie ist als amtliche Methode nach 35 LMBG L beschrieben mit dem Hinweis, dass sie nur dann eingesetzt werden soll, wenn andere Methoden nicht anwendbar sind. Die photometrische Methode Sie nutzt ebenfalls den unterschiedlichen Gehalt an Cystin und Cystein im Casein und in den Molkenproteinen. Nach einer sehr aufwendigen Probenvorbereitung kann durch die Ninhydrinreaktion eine im sichtbaren Bereich meßbare Färbung erzeugt werden, die dann durch eine einfache photometrische Messung den Cystinwert liefert, der ein Maßstab für den Molkenproteinanteil ist. Die elektrophoretische Methode Durch Auftrennung der einzelnen Eiweißbestandteile in einem elektrischen Feld, ihre Anfärbung und anschließende densitometrische Auswertung kann der Molkenproteinanteil bestimmt werden. Man nutzt dabei die SDS-Elektrophorese. Das SDS (sodium dodecyl sulfate) ist ein anionisches Detergenz, das die Eigenladungen von Proteinen überdeckt und so Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheiten entstehen. Diese Methode erfordert viel Erfahrung, eine entsprechende Ausrüstung und ist nicht für abgebaute Proteine anwendbar. Auch die Kapillar-Elektrophorese ist für diese Anwendung geeignet (s. z.b. Miralles). Die Elektrophorese ist als amtliche Methode nach 35 LMBG L auch für Speisequark anwendbar. Die derivativspektroskopische Methode Diese Methode beruht darauf, dass der Gehalt der Aminosäure Tryptophan im Molkenprotein höher als der im Casein ist. Da im UV-Spektrum der Eiweiße nur die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und in wesentlich geringerem Maße Phenylalanin zu finden sind, kann trotz Überlagerung der Spektren aus dem Derivativspektrum das Verhältnis des Molkenproteins zum Gesamteiweiß ermittelt werden. Dabei steht der Quotient eines Peaks bei 283,5 nm, zu dem sowohl Tryptophan als auch Tyrosin beitragen, für das Gesamteiweiß und eines Minimums bei 294,5 nm, an dem Tyrosin fast keinen Beitrag leistet, für den Gehalt an Molkenproteinen (Lüthi-Peng). Die Derivativspektroskopie ist als amtliche Methode nach 35 LMBG L beschrieben und dort auch für Speisequark ausgewiesen. Vergleich der Methoden Keine der amtlichen Methoden ist als Referenzmethode benannt. Aus der Literatur sind Methodenvergleiche bekannt, die unterschiedliche Ergebnisse bei Anwendung der verschiedenen Methoden belegen (Lechner, Miralles). Diese Unterschiede können erheblich sein und bei der Bewertung des Molkenproteingehaltes mit dem oberen Grenzwert von 18,5 % ohne Angabe einer verbindlichen Methode zu Problemen führen.

5 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.4 von 12 UV-Derivativspektroskopie Der UV-Bereich wird für die organische Analytik im wesentlichen nur für photometrische Messungen, also zur Konzentrationsbestimmung auf der Grundlage des Lambert-Beerschen Gesetztes genutzt. Die Aufnahme kompletter Spektren beschränkt sich auf nur wenige Gebiete, da die Spektren wenig aussagekräftig sind und sich zudem überlagern. Bei den Eiweißen tragen nur diejenigen Aminosäuren zum UV-Spektrum bei, die a- romatische Gruppen enthalten, und das sind wie oben erwähnt nur Tryptophan, Tyrosin und in wesentlich geringerem Maße Phenylalanin. Die Spektren dieser drei Aminosäuren überlagern sich. Die Bildung der Ableitungen bringen die einzelnen Komponenten deutlich besser zur Geltung. So erscheinen z. B. Schultern im Originalspektrum insbesondere in den geradzahligen Ableitungen als Peaks und lassen sich so den Komponenten zuordnen, wie das in der Abbildung für die Molkenproteine sehr deutlich zu sehen ist: Für die Durchführung der Differentation gibt es zahlreiche Möglichkeiten. Es gibt mechanisch-elektrische Methoden, optische Methoden, analoge elektronische Glieder und digitale Berechnungsmethoden. Durch die Fortschritte der Rechentechnik ist heute fast jedes Spektralphotometer mit einer digitalen Auswertemöglichkeit ausgerüstet. Es gibt verschiedene numerische Methoden zur Bildung der 4. Ableitung. Die am weitesten verbreitete Methode ist die nach Savitzky und Golay. Sie hat zwei frei wählbare Parameter: Der Abstand der zur Berechnung herangezogenen Wellenlängen und deren Anzahl (Filterzahl oder Stützstellen genannt). Die Auswirkung der Zahl der Stützstellen auf die Form der 4. Ableitung ist im folgenden zu sehen:

6 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.5 von 12 Originalspektrum 4. Abl. (5 Stützstellen) 4. Abl. (7 Stützstellen) 4. Abl. (9 Stützstellen) 4. Abl. (11 Stützstellen) Überlagerung Man sieht, dass das Ergebnis der Näherungsrechnung stark von den gewählten Parametern abhängt. Mit steigender Anzahl der Stützstellen werden die absoluten Werte auf der y-achse kleiner. Die Überlagerung der 4 Ableitungen zeigt, dass sich auch die Wellenlängen der Peaks verschieben. Besonders auffällig ist das bei dem in die Berechnung eingehenden Minimum bei 283 nm. Das Messintervall betrug in jedem Fall 1 nm. Ein ähnliches Bild gibt die Variation des Messintervalls. Die gleichen Berechnungsbedingungen für die Messstandards und die Proben bringt zwar ein in sich konsistentes System. Eine komplette Messung und Durchrechnung mit verschiedenen Messintervallen und verschiedener Anzahl Stützstellen mit gleichen Messstandards und gleichen Proben ergibt aber doch voneinander etwas abweichende Ergebnisse. Man muß sich dabei bewußt machen, daß man mit einem mathematischen Näherungsverfahren arbeitet. Die amtliche Methode Die Einzelheiten sind in der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach 35 LMBG unter L beschrieben. Hier sollen nur die kritischen Punkte angesprochen werden. Im Rahmen der Verwaltungsvorschrift zur Qualitätsprüfung von Milch, Milcherzeugnissen, Butter und Käse des TMLNU sind u.a. die Molkenproteine im Speisequark zu bestimmen. Die Untersuchungen dazu wurden für die TLL durch Dr. Reichardt eingearbeitet. Er wählte die derivativspektroskopische Methode aus und passte sie im Rahmen des Spielraumes der Methode an. Bei der innerbetrieblichen Verlagerung der Untersuchung zur AG 262 wurde sie mit diesen Details und auch mit den bis dahin verwendeten Kalibrierstandards übernommen. Die Wiederholbarkeit und Stabilität der Ergebnisse entsprach jedoch nicht den Erwartungen, so dass Ausreißer und andere Unregelmäßigkeiten zu Mehraufwand

7 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.6 von 12 durch Wiederholungen führten und die Durchführung insgesamt nicht zufriedenstellend war. Zunächst wurde nach den Spielräumen gesehen, die die Methode zulässt. Dabei fallen einige für amtliche Methoden ungewöhnliche Formulierungen auf: Sofern einstellbar, sollte eine Spaltbreite von 2,0 nm und eine Glättung von 0 nm gewählt werden. Falls das Gerät entsprechende Optionen bietet, sollte die Anzahl der Datenpunkte zur Berechnung der vierten Ableitung auf einen Wert von 9 eingestellt werden. Die Geräte der verschiedenen Hersteller unterscheiden sich in ihrer Handhabung zur Messung und Berechnung der Derivativspektren. Deshalb sind die über die Festlegungen dieser Norm hinausgehenden Anweisungen der Gerätehersteller zu beachten. Vergleichende Untersuchungen haben gezeigt, dass einige Geräte Derivativspektren liefern, die zur Bestimmung des Molkenprotein- bzw. Caseinanteils entsprechend des in dieser Norm festgelegten Verfahrens nicht geeignet sind. Deshalb wird ein geräteunabhängiger Algorithmus angegeben, der auf dem Algorithmus nach Savitzky und Golay beruht und sich auf 7 Datenpunkte stützt. Der Algorithmus nach Savitzky und Golay ist der ohnehin von den meisten Geräteherstellern verwendete. Nur wurden, wie aus dem weiter oben angegebenen Zitat ersichtlich, an anderer Stelle möglichst 9 Datenpunkte gefordert. Diese Formulierungen binden den Anwender, der die Parameter einhalten kann, lassen aber dem, dem das nicht möglich ist, freie Hand bei der Wahl der Parameter. Das wirft natürlich bei Problemen die Frage auf, wie wichtig es ist, diese Soll - Parameter einzuhalten. Untersuchungen dazu führten zu interessanten Ergebnissen. Die Umsetzung der Methode mit dem Cary 100 Da in der AG 262 kein modernes Spektralphotometer zur Verfügung stand, konnten bei der Anschaffung eines Neugerätes alle Kriterien, die die Molkenproteinbestimmung forderte, als Mindeststandards angesehen werden. Alle Geräte, die diese Ansprüche erfüllen, sind auch für die sonstigen in der Routinearbeit anstehenden photometrischen Aufgaben der Arbeitsgruppe geeignet und bieten die im Rahmen der Akkreditierung wichtigen Möglichkeiten zur Qualitätssicherung und Dokumentation, sind für künftige Aufgaben flexibel, verarbeiten die Messergebnisse und vermeiden so Fehlerquellen und sparen Arbeitszeit. Zu den technischen Besonderheiten bei der Auswahl des Gerätes, die grundlegenden Verbesserungen für die Laborarbeit sowohl für die allgemein anfallenden photometrischen Arbeiten als auch auf die Bestimmung der Molkenproteine sei auf den Bericht zur Inbetriebnahme des UV-Vis Spektrometers Cary 100 vom März 2004 hingewiesen und sie sollen im Rahmen des Zwischenberichts nicht zusammenfassend wiederholt werden. Zur Aktualisierung sei aber ergänzt: Bei den photometrischen Methoden wurde die Bestimmung von Nitrit und Nitrat eingearbeitet. Das Zusatzprogramm für die derivativspektroskopische Bestimmung der Molkenproteine durch die Fa. Varian liegt in der nunmehr 3., der endgültigen Version vor. Es wurde schrittweise im Dialog zwischen Programmierer und Anwender erstellt.

8 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.7 von 12 Damit ist es möglich, die Auswertung zügig vorzunehmen. Bisher erforderte die Auswertung etwa den gleichen Zeitaufwand wie die Messung selbst. Mit dem Zusatzprogramm kann wenige Minuten nach der Messung die Auswertung vorliegen. Außerdem ist es möglich, Auswertungen abgeschlossener Messungen vorzunehmen, während nachfolgende Messungen durchgeführt werden. Insgesamt ist damit in allen Punkten der Zielsetzung eine wesentliche Verbesserung erreicht. Trotzdem ist die Situation nicht ganz zufriedenstellend. Problemanalyse Insbesondere bei der Wiederholbarkeit treten Streuungen auf, die mit dem neuen Gerät keine Verbesserungen gebracht haben und deshalb vermutlich geräteunabhängig sind. Auch ein Bericht von Reichardt und von ihm vorliegende unveröffentlichte Messungen legen nahe, dass noch andere Zusammenhänge dafür verantwortlich sind. Bei dem derivativspektroskopisches Verfahren wird die Extinktion zwischen 250 und 320 nm gemessen. Davon ist die 4. Ableitung zu bilden. Es ist das Maximum bei ca. 283 nm und das Minimum bei ca. 295 nm zu ermitteln und aus beiden der Quotient zu bilden. Es ist jeweils eine Fünfachmessung durchzuführen und der Mittelwert zu bilden. Als Beispiel sind die Werte einer Zehnfachmessung angeführt: I1A05/Q1 283 nm 295 nm Quotient Molkenproteinanteil Extinktion 4.Ableitung Extinktion 4.Ableitung ADL Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum Spektrum MW StAbw MittlAbw Max Min Max-Min Obwohl bei der Aufnahme der 10 Spektren die Küvette nicht bewegt wurde und die Messung durch automatische Wiederholung unmittelbar aufeinanderfolgend durchgeführt wurde, ergeben sich bereits in der dritten Nachkommastellen Differenzen. Im Verlauf der weiteren Berechnung vergrößern sich diese Streuungen bei der Bildung

9 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.8 von 12 des Quotienten und weiter durch die Eigenschaft der Kalibrierkurve (flacher Verlauf) bei der Berechnung des Molkenproteinanteils. Ganz deutlich wird das, wenn man die Differenz zwischen Maximal- und Minimalwert des Molkenproteins betrachtet. Daß es sich um zufällige Schwankungen handelt, muß man annehmen, wenn man die graphische Darstellung betrachtet. Die blauen Punkte sind die Quotienten, die roten der Molkenproteinanteil. Es ist kein systematischer Gang zu erkennen. 35 Streuung des Quotienten und des Molkenproteinanteils Spektrum 1 Spektrum 2 Spektrum 3 Spektrum 4 Spektrum 5 Spektrum 6 Spektrum 7 Spektrum 8 Spektrum 9 Spektrum 10 Es wurde systematisch nach der Ursache gesucht. Zunächst wurde das Rauschen des Gerätes ohne jede Küvette über 1 Minute verfolgt:

10 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.9 von 12 Wie man sieht, erhält man ein gleichmäßiges Rauschen um den Mittelwert von ca. 0, Das Rauschen der GNA-Pufferlösung 5 Minuten gemessen gegen eine Leerküvette ergibt folgendes Bild: Das Rauschen selbst um den Mittelwert ist nur unwesentlich größer. Es überlagert sich aber noch eine Schwankung um den Mittelwert, so daß insgesamt Schwankungen von 0,0008 auftreten können, je nachdem zu welchem Zeitpunkt die Messung durchgeführt wird. Führt man die Messung für eine Quarkprobe gemessen gegen die GNA-Pufferlösung durch, wird das Meßergebnis noch stärker vom Zeitpunkt abhängig:

11 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.10 von 12 In der Abbildung sind Unterschiede in der Extinktion von 0,0030 in Abhängigkeit vom Meßzeitpunkt zu sehen, die bei Verlängerung des Beobachtungszeitraumes vermutlich noch größer sein können. Um einen brauchbaren Mittelwert für die Extinktion zu erhalten, müßte dieverweilzeit deutlich über die gezeigten 5 Minuten vergrößert werden. Vorgegeben sind 0,5 sec. Das würde zu absurd langen Meßzeiten für ein Spektrum führen. Daß auch das zu keiner Verbesserung führen würde, zeigt folgender Versuch. Es wurden 3 Spektren unter folgenden Bedingungen aufgenommen: 1. Spektrum: Intervall 1 nm; Verweildauer pro Wellenlänge: 0,5 s 2. Spektrum: Intervall 1 nm; Verweildauer pro Wellenlänge: 60 s 3. Spektrum: Intervall 1 nm; Verweildauer pro Wellenlänge: 0,5 s Die Mittelwerte der Extinktion im ersten (blaue Säulen) und im letzten (gelbe Säulen) Spektrum, zwischen deren Messung ein Zeitraum von etwa 20 Stunden liegt, ohne daß die Küvette bewegt wurde, unterscheiden sich erheblich. Die 10 Meßwerte wurden jeweils im Abstand von jeweils 30 s aufgenommen. Die Extinktion der 10 Einzelmessungen des zweiten Spektrums, zwischen denen jeweils etwa 60 Minuten

12 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.11 von 12 liegen, zeigt keine übliche statistisch bedingte Streuung, sondern eine stetige Verkleinerung. Alle bisherigen Untersuchungen zur zeitlichen Schwankung der Extinktion wurden an einer willkürlich herausgegriffenen Wellenlänge von 280 nm dargestellt. Die Schwankung zwischen den jeweiligen 10 Einzelwerten in Abhängigkeit von der Wellenlänge zeigt die folgende Abbildung: Die mittleren Abweichungen des zweite Spektrums sind erwartungsgemäß deutlich größer als die der anderen beiden Spektren und sind auch wellenlängenabhängig. Um die Verhältnisse bei den beiden anderen Spektren besser herauszustellen, sind die Abweichungen noch einmal in einem anderen Maßstab dargestellt: Die Streuungen sind kaum von der Wellenlänge abhängig. Lediglich in dem Gebiet um 285 nm sind sie auffällig größer. Es ist aber auch zu sehen, daß die Streuung nach einer Standzeit der Küvette von etwa 20 Stunden nur noch etwa halb so groß ist. Aus den bisherigen Ergebnissen muß man den Schluß ziehen, dass das Problem durch die Probenvorbereitung entsteht. Die Proben sind nicht ausreichend homogen. Durch die Proben bedingte Störungen führen zu Schwankungen des Messwertes in Abhängigkeit vom Messzeitpunkt.

13 Themen Nr.: /2004 Zwischenbericht Dr. Gottschlich S.12 von 12 Dazu wurden eine Reihe von Versuchen durchgeführt, die noch nicht abgeschlossen sind und deren Ergebnisse im Abschlußbericht vorgelegt werden. Literatur Miralles, B. Determination of whey protein to total protein ratio in UHT milk using fourth derivative spectroscopy Intern. Dairy Journal (2000) 10(3) Miralles, B. Comparison of three methods to determine the whey protein to total protein ratio in milk J. Dairy Sci. (2000) Lüthi-Peng, Qiao-Qian, Z. PUHAN The 4 th derivative UV spectroscopic method for a rapid determination of protein and casein in milk Milchwiss. (1999) 54(2) Antonov, Liudmil Fourth derivative spectroscopy a critical view Analytica Chimia Acta (1997) Klostermeyer, H. Zur Rolle der Molkenproteine in Frischkäse dmz (1990) Erika Lechner Bestimmung des Molkenproteinanteils im Gesamtprotein von Frischkäse und gereiftem Käse dmz (1990) Reichardt, Werner Erfahrungen mit verschiedenen Referenzstandards bei der UVderivativspektroskopischen Bestimmung des Molkenproteinanteils von Quark nach DIN Talsky, Gerhard Derivative Spectrophotometry VCH Verlagsges., Weinheim 1994 Havel, Henry A. Spectroscopic Methods for Determining Protein Structure in Solution VCH Publishers Inc. NewYork 1996