Einsatz der Flowzytometrie in der zytologischen Diagnostik

Transkript

1 SMZ Baumgartnerhöhe Otto Wagner Spital Institut für Labordiagnostik Vorstand: Prim. Univ. Doz. Dr. W. Hübl Einsatz der Flowzytometrie in der zytologischen Diagnostik K. Bernhardt

2 Einsatzbereich der Flowzytometrie in der Zytologie Technische Grundlagen Interpretation der Scattergramme Stärken der Flowzytometrie, AK- Spektrum Interpretationsgrundlagen Einsatzbereich in Routinediagnostik Materialien + klinische Fragestellung Fallbeispiele Scattergramme - flowzytometrische Kriterien Zelllinie Klonalität (ungewöhnliche) Ag-Kombinationen AG-Dichte

3 Grundlagen der Flowzytometrie (Lymphozytensubtypisierung) Bestimmung von Antigenen / Rezeptoren Kernmembran / Zytoplasma direkten Methode Primärantikörper sind mit Fluorochromen markiert Fluorochrome werden mit Lichtquellen (Laser) angeregt PE, FITC, PerCP (Cy5), APC Messung von 3 Parametern Zellgröße - Vorwärtsstreulicht (FSC) Zellgranularität - Seitwärtsstreulicht (SCC) Fluoreszenz Neben der Zellmorphologie werden (routinemäßig) 4 bis 6 Zellcharakteristika bestimmt

4 Abfall Meßküvette Laserstrahl Trägerflüssigkeit Druckluft hydrodynamische Fokusierung Probe

5 Fluoreszenzstärke / AG-Dichte Granularität SCC SG 1 T-Suppressorzellen T-Zytotoxische Zellen SG 2 CD 8 T-Helferzellen CD 45 CD 4 B-Zellen SG 3 NK-Zellen SG 4 CD 19 CD 16/56 T-Zellen T-Zellen CD 3 CD 3

6 Antikörper in der Flowzytometrie CD 1a CD 2/3/7 CD 3/4 CD 5 CD 3/8 CD 10 CD 11c/14 CD 16/56/57 CD 19/20/22 CD 34 CD 45 CD 138 HLA-DR Kappa/Lamba TCR V Beta Annexin / PI Thymozyten T-Lymphozyten T-Helferzellen T-Lymphozyten, B-Lymphozyten Subset T-Zytotoxische, NK-Zellen (CD 3 neg.) Pre-B- Lymphozyten Monozyten, Makrophagen, Granulozyten NK- Lymphozyten, B- Lymphozyten Vorläuferzellen Leukozyten Plasmazellen MHC Klasse II Immunglobulinleichtkette T-Zellrezeptor Apoptose, DNA (PI Propidiumiodiod)

7 Stärken der Flowzytometrie in der Zelltypisierung Typisierung von lymphatischen Zellen automatisierte Messung hoher Zellzahlen gute Beurteilbarkeit von Verhältnissen Mehrfachfärbung an einer Zelle Erfassung der Rezeptordichte Zellschonend Schwächen der Flowzytometrie in der Zelltypisierung nicht jedes Material ist verwendbar Morphologie nur grob beurteilbar Einzelzellen schlecht erfassbar (außer bei unphysiologischer AG-Expression) Unspezifische Fluoreszenz (z.b. Makrophagen) AK-Spektrum (CD)

8 Flowzytometrie in der Routinediagnostik Phänotypisierung lymphatischer Zellen / Immunstatus Leukämie und Lymphomdifferenzierung Interstitielle Lungenerkrankungen Hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen HLA B27 M. Bechterew, Vβ2 Kawasaki Syndrom Retikulozyten, Thrombozyten Residuale Leukozyten in Blutkonserven LDL Rezeptor familiäre Hypercholesterinämie DNA Analyse (Propidiumiodid) / Apoptose (Annexin V) intracellular functional markers (cytokines), cell-signaling Molecules simultaneously measuring of multiple soluble analytes Oxydative Burst Defekt der NADPH Oxydase Cross Match bei Organtransplantation HLA DR auf Monozyten / Immunsuppression U. Sack J Lab Med /24(6/7)

9 Material und Fragestellung BAL EAA Sarkoidose interstitieller Strukturvermehrung NHL Körperhöhlenergüsse NHL Liquor NHL Aufschwemmungen (Bürste, Nadel, Biopsie, Objektträger) NHL

10 Interpretationsgrundlagen Die meisten Antigene können physiologischerweise auf normalen" lymphatischen Zellen vorkommen zytologische Beurteilung muss der Flowzytometrie vorausgehen Zellmorphologie muß bei Auswahl der zu bestimmenden Zellen berücksichtigt werden Ausschluß von Zellen mit unspezifischer Positivität (Makrophagen!) Welche Zellen & welche % Verteilung sind zu erwarten BAL / Erguss / Liquor nur reife lymphatische Zellen geringer B-Zellanteil Lymphknoten lymphatische Zellen aller Reifestadien variabler, jedoch höherer B-Zellanteil

11 Follikuläre Hyperplasie

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13 Basisdiagnostik * interstitielle Lungenerkrankungen (CD4/CD8) * B-Non Hodgkin Lymphome (Zelllinie + Klonalität + aberrante AG-Expression) FITC PE PerCP (Cy5) APC CD 3 CD 8 CD 45 CD 4 CD 3 CD 16/56 CD 45 CD 19 CD 5 CD 19 CD 45 CD 23 Kappa Lambda CD 19 CD 45 CD 43 CD 79b CD 19 CD 20 pb CD 24 CD 38 CD 19 CD 10 pb CD 38 CD 138 CD 45 CD 19 rj CD 103 CD 11c CD 20 CD 19 igld CD 7 CD 2 CD 3 CD 5 igld CD 8 CD 38 CD 45 CD 14 diff OWS 2010

14 Screeningpanel 6 Farben FITC PE PerCP PE-CY 7 APC APC-CY 7 5 µl 5 (15) µl 5 µl 3 µl 1 µl 3 µl CD 3 CD 19 CD 45 CD 10 CD 34 CD 14 CD 3 CD 19 CD 45 CD 4 CD 8 CD 20 CD 57 CD 16/56 CD 45 CD 38 CD 3 HLA DR R. Jilch, 2. Hämatoonkologischer Zirkel 2007

15 Screeningpanel B-NHL 6 Farben FITC PE PerCP PE-CY 7 APC APC-CY 7 5 µl 5 (15) µl 5 µl 3 µl 1 µl 5 µl CD 43 CD 23 CD 20 CD 5 CD 10 CD 19 CD 103 CD 25 CD 20 CD 5 CD 11c CD 19 CD 79b 1:7 IgM CD 20 CD 38 HLA-DR CD 19 Kappa 7 µl CD 22 CD 20 CD 5 CD 19 Lambda 7 µl CD 52 CD 20 CD 25 CD 5 CD 19 Kappa Lambda CD 20 CD 10 CD 34 CD 19 Cy IgG1 Cy IgG1 CD 20 Cd 38 CD 19 Cy TDT Cy ZAP 7010 µl CD 20 CD 3 Cy Cd 79a CD 19 Leukämie-Lymphom Workshop IGLD 2008

16 Klonalitätsnachweis B-Zellen

17 Basisdiagnostik * interstitielle Lungenerkrankungen (CD4/CD8) * T-Non Hodgkin Lymphome (Zelllinie + Klonalität + aberrante AG-Expression) FITC PE PerCP (Cy5) APC CD 3 CD 8 CD 45 CD 4 CD 3 CD 16/56 CD 45 CD 19 CD 5 CD 19 CD 45 CD 23 Kappa Lambda CD 19 CD 45 CD 43 CD 79b CD 19 CD 20 pb CD 24 CD 38 CD 19 CD 10 pb CD 38 CD 138 CD 45 CD 19 rj CD 103 CD 11c CD 20 CD 19 igld CD 7 CD 2 CD 3 CD 5 igld CD 8 CD 38 CD 45 CD 14 diff OWS 2010

18 Klonalitätsnachweis T-Zellen TCR V Beta Repertoire Kit (Differenzierung von 24 V Beta)

19 Lymphomdifferenzierung WHO Classification of lymphoid Tissue CD CD CD CD CD CD CD CD % c a sig Diffuse large B-cell lymphoma - + +/- + + Bcl2 31 Follicular lymphoma (cb/cc) /- + + Bcl2 22 Ex.(nod.) marginal zone B-cell lymphoma (MALT) - - +/ /35 8 Peripheral T-cell lymphoma 5/7 +/- 56/4 8 small lymphocytic lymphoma (CLL) + - +/ /- + 7 Mantle cell lymphoma (cc) Bcl2 6 Burkitt lymphoma Bcl6 3 Anaplastic large cell lymphoma 2/4 +/- EMA 3 Splenic marginal zone lymphoma (SLVL) Lymphoplasmacytic lymphoma (Waldenström) IgM 1 Hairy cell leukemia Plasma cell myeloma/plasmacytoma ([extra]oss.) 56 - (+/-) + cig 138 Literatur: Tumours of Haemapoietic and Lymphoid Tissues, WHO

20 Chronic Lymphoproliferative Disorders of B-Cell Type B CLL B PLL MZ FCL LPL/IZ NMZL SMZL HCL MM Slg w CD5 + w + (+/-) (weak/schweif) CD10 + /+ CD CD20 CD22 CD23 CD24 CD43 CD79b CD103 CD138 FMC7 CD200 w w +/ /+ (+/-) var (+) + + (+/-) + (-) (weak) (+) (+/-) B-PLL: Pro Lymphozyten Leukämie FCL: Follikelzell Lymphom HCL: Haarzellleukämie MZ: Marginalzelllymphom (Cyclin D1 +) LPL/IZ: Lymphplasmozyt. L. / Immunozytom MM: Multiples Myelom SMZL: Splenic Marginal Zone Lymphoma MZL: Mantelzelllymphom ( + Cyclin D1 positiv) Prof. Dr. P. Bettelheim 2008, Doz. Dr. W. Hübl 2011

21 BAL Plasmazellen interstitielle Lungenerkrankung oder NHL CD 138 Plasmazellen

22 Blut - small lymphocytic lymphoma (CLL) CD 19 BAL Lungenmitbeteiligung???

23 CD 19 B-NHL (Marginalzonenlymphom) Pleurapunktat (Pleurapunktat)

24 Diffus großzelliges EBUS NHL (EBUS)

25 CD 138 Plasmazellen Plasmozytom CT- gezielte transthorakale Biopsie (CT- gezielte transthorakale Biopsie) CD138

26 Peripheral T-cell Pleurapunktat lymphoma (Pleurapunktat)

27 CD 4 CD 8 Lymphoproliferative Erkrankung / T-NHL (Bronchoskopie - Biopsie) Aufschwemmung von Objektträger - Drob Histo:... es sind bei weitem die meisten Zellen CD3 + und CD CD 4 PE CD 8 PE CD 3 APC CD 3 APC

28 Blut Pleuraerguss Mediastinum T-ALL

29 Zusammenfassung Einsatzbereich interstitielle Lungenerkrankungen Lymphomdiagnostik Morphologie = Grundvorausssetzung Antikörperauswahl T oder B Zellen, Klonalität Ungewöhnliche AG-Verteilung Stärken Bestimmung von Zellverhältnissen Mehrfarbenfluoreszenz Einobjekträgermethode

30 Danke für Ihre Aufmerksamkeit