Grundlagen der Apoptose. Frank Essmann

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1 Grundlagen der Apoptose Frank Essmann

2 Agenda Was ist Apoptose? (Morphologische u. biochemische Charakteristika) Molekulare Grundlagen (pro- u. anti-apoptotische Mechanismen) Apoptose-Signalkaskade intrinsisch / extrinsisch Physiologische u. pathophysiologische Funktionen Apoptose in Tumor- und anderen Erkrankungen Ausgewählte Aspekte der Apoptose

3 Zwei Arten von Zelltod

4 Arten des Zelltods Nekrose Zellen schwellen an Kern schwillt an Vakuolen Apoptose Zellen schrumpfen Chromatin kondensiert Membrane blebbing Immunantwort (Entzündungsreaktion) reguläre Phagozytose keine Immunantwort

5 Arten des Zelltods Nekrose Zellen schwellen an Kern schwillt an Vakuolen Autophagie Apoptose Zellen schrumpfen Chromatin kondensiert Membrane blebbing Immunantwort (Entzündungsreaktion) reguläre Phagozytose keine Immunantwort

6 Autophagie QuickTime and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture.

7 Nekrose QuickTime and a Sorenson Video decompressor are needed to see this picture.

8 Apoptose QuickTime and a H.263 decompressor are needed to see this picture.

9 Charakteristika der Apoptose Morphologische: Membrane Blebbing Chromatin-Kondensation Nukleäre Fragmentierung Verlust der Adhäsion, Abrundung Zelle schrumpft Apoptotische Körperchen ( apoptotic bodies ) Phagozytose (Absorption) durch Macrophagen oder benachbarte Zellen 2.2 µm Biochemische: Spaltung genomischer DNA -> DNA-Leiter Externalisierung von Phophatidylserin Proteolytische Spaltung intrazellulärer Substrate Aktivierung distinkter Proteasen (Caspasen: Aspartat spezifische Cysteinyl-Proteasen)

10 Charakteristika der Apoptose Morphologische: Membrane Blebbing Chromatin-Kondensation Nukleäre Fragmentierung Verlust der Adhäsion, Abrundung Zelle schrumpft Apoptotische Körperchen ( apoptotic bodies ) Phagozytose (Absorption) durch Macrophagen oder benachbarte Zellen Biochemische: Spaltung genomischer DNA -> DNA-Leiter Externalisierung von Phophatidylserin Proteolytische Spaltung intrazellulärer Substrate Aktivierung distinkter Proteasen (Caspasen: Aspartat spezifische Cysteinyl-Proteasen)

11 Charakteristika der Apoptose Morphologische: Membrane Blebbing Chromatin-Kondensation Nukleäre Fragmentierung Verlust der Adhäsion, Abrundung Zelle schrumpft Apoptotische Körperchen ( apoptotic bodies ) Phagozytose (Absorption) durch Macrophagen oder benachbarte Zellen Biochemische: Spaltung genomischer DNA -> DNA-Leiter Externalisierung von Phophatidylserin Proteolytische Spaltung intrazellulärer Substrate Aktivierung distinkter Proteasen (Caspasen: Aspartat spezifische Cysteinyl-Proteasen) Agarosegel

12 Internukleosomale DNA-Spaltung Chromatin-Organisation DNA Doppelhelix Nukleosomales Filament Chromatin Filament Übergeordnete Strukturen

13 Internukleosomale DNA-Spaltung Chromatin-Organisation DNA Doppelhelix Nukleosomales Filament Chromatin Filament

14 Internukleosomale DNA-Spaltung DNA-Spaltstellen von Endonukleasen Zur Anzeige wird der QuickTime Dekompressor Animation benötigt. Agarosegel

15 Physiologische Rolle der Apoptose Deletion unerwünschter Zellen: A. Formgebung B. Deletion überflüssiger Strukturen C. Kontrolle der Zellzahl (cell turnover) D. Eliminierung autoreaktiver Thymozyten E. Regulation der Immunantwort F. Eliminierung von Tumorzellen und virusinfizierter Zellen A B Müllerian duct Wolffian duct C apoptotisch cells 3-5 days Stem cells

16 Rolle der Apoptose Physiologische Rolle der Apoptose während w der Embryonalentwicklung (in Vertebraten) bei der Homöostase ostase (Erhalt der Gewebsstruktur) im Immunsystem - negative Selektion - Regulation der Immunantwort - Deletion infizierter und abnormer Zellen Pathophysiologische Rolle der Apoptose bei unzureichender Apoptose Autoimmunerkrankungen Krebs Virusinfektion... bei übermäßiger Apoptose AIDS Schlaganfall bei neurodengenerativen Erkrankungen - Alzheimer - Parkinson - Retinitis Pigmentosa

17 Homöostase ostase Leben Teilen Differenzieren Sterben Teilen Sterben

18 Homöostase ostase Leben Teilen Differenzieren Sterben Sterben Teilen Gleichgewicht

19 Physiologische Rolle: Embryonalentwicklung Fuß eines Mäuseembryos. Die Ausbidung der Extremitäten beginnt bei den meisten Säugetieren als Flosse ohne Finger oder Zehen.. Kurz darauf entstehen Bereiche apoptotischer Zellen (interdigitale apoptotische Regionen) - zwischen den Bereichen, welche die Finger oder Zehen bilden werden. Diese sterbenden Zellen werden von Makrophagen aufgenommen, die zu diesen Bereichen wandern (grün). Zurück bleiben die zukünftigen Zehen bzw. Finger.

20 Physiologische Rolle: Phagozytose

21 Apoptose-Signale Intrinsische Signale (Die Zelle detektiert selbst, daß sie überflüssig oder schädlich ist.) Extrinsische Signale Stress (Reaktive( Sauerstoff- verbindungen ROS,, Ca 2+, ph, ATP-Level, Glukose-Level) Chemotherapeutische Agentien UV-Strahlen > DNA-Schaden (Die Zelle erhält ein Aktivierungs- signal für f Apoptose.) Entzug von Wachstumsfaktoren Entzug von Überlebensfaktoren (Anoikis = Verlust der Adhäsion an die extrazelluläre re Matrix) Todesliganden (Death Ligands)

22 Apoptose-Mechanismen Wurm (Nematode( Nematode) Fruchtfliege Mensch C. elegans Caenorhabditis elegans Drosophila Drosophila melanogaster Homo sapiens Invertebraten Vertebraten C. elegans besteht aus 1090 somatischen Zellen, 131 Zellen sterben durch Apoptose,, so daß 959 Zellen den voll entwickelt- en Wurm bilden.

23 Apoptose-Mechanismen Wurm (Nematode( Nematode) Fruchtfliege Mensch C. elegans Caenorhabditis elegans Drosophila Drosophila melanogaster Homo sapiens Invertebraten Vertebraten Einfaches Modell - evolutionär einfacher, prototypischer Organismus oder - stark komprimierte oder vereinfachte Version eines komplexeren Organismus.

24 Apoptose-Mechanismen Wurm (Nematode( Nematode) Fruchtfliege Mensch C. elegans Caenorhabditis elegans Drosophila Drosophila melanogaster Homo sapiens Invertebraten Vertebraten Einfaches Modell Komplexes Modell - evolutionär einfacher, prototypischer Organismus oder - stark komprimierte oder vereinfachte Version eines komplexeren Organismus.

25 Apoptose-Mechanismen Wurm (Nematode( Nematode) Fruchtfliege Mensch C. elegans Caenorhabditis elegans Drosophila Drosophila melanogaster Homo sapiens Invertebraten Vertebraten Einfaches Modell Komplexes Modell Komplexeres Modell - evolutionär einfacher, prototypischer Organismus oder - stark komprimierte oder vereinfachte Version eines komplexeren Organismus.

26 Apoptose: : Evolutionäre Konservierung Caenorhabditis elegans Regulator EGL-1 CED-9 Adapter CED-4 QuickTime and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture. Effektor CED-3 Apoptose

27 Apoptose: : Evolutionäre Konservierung Caenorhabditis elegans Vertebraten EGL-1 Adapter CED-9 CED-4 Intrazelluläre Membran Mitochondrium Bcl-2 Apaf-1 Bik Bad Effektor CED-3 Caspase-9 Apoptose Apoptose intrinsisch

28 Apoptose: : Evolutionäre Konservierung Caenorhabditis elegans Vertebraten EGL-1 Adapter CED-9 CED-4 Intrazelluläre Membran Mitochondrium Bcl-2 Apaf-1 BH3-only Rezeptor CD95 FADD Plasmamembran Effektor CED-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-8 Apoptose Apoptose intrinsisch extrinsisch

29 Caspasen Erstmals 1992 beschrieben (ICE: Interleukin-1β Converting Enzyme) Identifizierung von CED-3 in C. elegans - notwendig für Apoptose - ist identisch mit ICE Familie der Cystein-Proteasen, spalten nach Aspartat (Cysteinyl-Aspartasen) 1994 erste Struktur veröffentlicht (Wilson et al., Nature, 1994)

30 Humane Caspasen Caspase-5 CARD L S Caspase-4 CARD L S Caspase-1 CARD L S Caspase-7 L S Caspase-3 L S Caspase-6 L S Caspase-8 DED DED L S Caspase-10 DED DED Caspase-9 CARD L S Caspase-2 CARD L S Caspase-14 L S Differenzierung von Keratinozyten? L S Induktion Exekution Inflammation? CARD: Caspase recruiting domain DED: death effector domain L: large subunit S: small subunit

31 Humane Caspasen Caspase-7 L S Caspase-3 L S Caspase-6 L S Caspase-8 DED DED L S Caspase-10 DED DED Caspase-9 CARD L S Caspase-2 CARD L S L S Exekution Induktion CARD: Caspase recruiting domain DED: death effector domain L: large subunit S: small subunit

32 Caspasen - in anderen Organismen Mensch und Maus Caspase-1 Caspase-2 Caspase-3 Caspase-4 Caspase-5 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-11 Caspase-12 Caspase-14 C. elegans CED-3 CSP-1 CSP-2 Drosophila Caspases Drosophila melanogaster DAMM DCP-1 DECAY DREDD DrICE DRONC STRICA Zebrafisch Caspy-1 Caspy-2 Casp-3 Casp-8 Pyrin Pyrin DED Death effector domain Pyrin Pyrinreiche Domäne / DAPIN CARD Caspase recruitment domain unbekanntes Motif

33 Aktivierung von Caspasen Inaktives Zymogen (Pro-Caspase-1) Prodomäne His-Cys Diade SHG QACRG p20 p10 Autoproteolyse des Intermediates Prodomäne p10 p20 identische oder andere Caspase p10 Prodomäne Aktive Caspase-1 (p20/p10) 2 Tetramer

34 Aktivierung von Effektor-Caspasen Inaktives Zymogen (Pro-Caspase-1) Prodomäne His-Cys Diade SHG QACRG p20 p10 Autoproteolyse des Intermediates Prodomäne p10 p20 identische oder andere Caspase p10 Prodomäne Aktive Caspase-1 (p20/p10) 2 Tetramer

35 Die Initiator-Caspase Caspase-9

36 Die Initiator-Caspase Caspase-9

37 Substratspezifität von Caspasen Tetrapeptid-Substratspezifität (P 4 -P 3 -P 2 -P 1 ) Asp an P 1

38 Apoptose-Signalkaskade Initiator- Caspase D D D D Caspase-8 Caspase-9 Apoptosesignal Effektor- Caspase Caspase-3 Caspase-6 Caspase-7 D Spaltung von Substraten D D A) Auflösung der Zellstruktur B) Chromatinkondensation DNA-Fragmentierung C) Inaktivierung von DNA-Reparatur und Überlebensproteinen

39 (Intrinsische) Caspase-Kaskade Caspase-9 Caspase-7 Caspase-3 Caspase-6 Caspase-2 Caspase-8 Caspase-10

40 Caspase-Substrate Inaktivierung von Apoptoseinhibitoren: CAD/ICAD CAD Degradation intrazellulärer Strukturen: Deregulation von Aktivitäten: + + Regulation Katalyse Regulation Katalyse

41 Chromatinkondensation und DNA-Fragmentierung Con ETO DOX TNF WT Con ETO Casp3 (-/-) Con ETO

42 Regulation (intrinsisch) Regulation (intrinsisch) Anti Anti-apoptotische apoptotische Bcl Bcl-2 Proteine Proteine Bcl Bcl-2 Bcl-xL Bcl-w Mcl-1 A1/Bfl1 Boo/Diva Nrf3 Bax Bax Bak Bok/Mtd Regulation Regulation Porenbildung Porenbildung Membrananker Membrananker Dimerisierung Dimerisierung BH3 BH4 TM BH1 BH2 BH3 TM BH1 BH2 BH3 BH3-only only Bim Bim Bid Bid Bad Bik Blk Bmf Hrk/DP5 Bnip3 Nix Noxa Puma BH3 TM BH3 Pro Pro-apoptotische apoptotische Bcl Bcl-2 Proteine Proteine

43 Entscheidung am Mitochondrium Freisetzung von Cytochrom c Apoptose

44 Cytochrom c als Signalprotein Pro-apoptotische Bcl-2 Proteine Anti-apoptotische Bcl-2 Proteine BH3-only Bax Bak Bcl-xL Bak Bax Bcl-2 Bcl-xL Bcl-w Mcl-1 Bcl-2 tbid BIk Bik Bim Puma Cyt C Mitochondrium

45 Cytochrom c als Signalprotein Pro-apoptotische Bcl-2 Proteine Anti-apoptotische Bcl-2 Proteine BH3-only Bax Bak Bax Bcl-2 Bcl-xL Bcl-w Mcl-1 BIK Bak tbid BIk Bik Bim Puma BIM Bcl-xL Bcl-2

46 Cytochrom c als Signalprotein Pro-apoptotische Bcl-2 Proteine Anti-apoptotische Bcl-2 Proteine BH3-only Bax Bak Bax Bcl-2 Bcl-xL Bcl-w Mcl-1 BIK Bak tbid BIk Bik Bim Puma BIM Bcl-xL Bcl-2 Oligoerisierung/ Cluster-Bildung

47 Wechselwirkung der BH3-only Proteine Bax Bak

48 Bax-Clustering QuickTime and a MPEG-4 Video decompressor are needed to see this picture.

49 Bax-clustering at the Mitochondria QuickTime and a Video decompressor are needed to see this picture.

50 Cytochrom c-freisetzung GFP-Cyt c Annexin-V DNA-dye

51 Cytochrom c-freisetzung QuickTime and a Motion JPEG A decompressor are needed to see this picture. GFP-Cyt c Annexin-V DNA-dye

52 Das Apoptosom Stress Anti-apoptotische Bcl-2 Proteine Smac/DIABLO IAPs Cytochrom c Mitochondrium Pro-apoptotische Bcl-2 Proteine Apaf-1 Apoptose Caspase-3 Caspase-7 Caspase-6 APOPTOSOM pro-caspase-9

53 Aktivierung von Apaf-1

54 Das Apoptosom

55 Zusammenfassung Effektor-Caspasen werden durch limitierte Proteolyse von Initiator-Caspasen aktiviert. Das Mitochondrium ist zentrale Regulationsstelle der intrinsisch vermittelten Apoptose. Proteine der Bcl-2-Familien regulieren die Freisetzung von Cytochrom c. Die Freisetzung von Cytochrom c initiiert die Bildung des Apoptosoms. Das Apoptosom wird von Apaf-1/Cyt c/caspase-9 unter Stabilisierung durch datp gebildet. Caspasen werden durch IAPs inhibiert (xiap inhibiert Caspase-9 und -3). Smac/DIABLO inaktivert (x)iap und aktiviert somit Caspase-9 und -3.