MVZ Mikrobiologie & UKE. Hepatitisdiagnostik
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- Fritzi Kappel
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1 MVZ Mikrobiologie & UKE Hepatitisdiagnostik
2 Hepatitisviren Virus Familie Struktur Genom Genotypen chron. Infektion HAV Picornaviren 27nm ohne Hülle ss(+)rna, 7.5kb 7 (I-VII) nein HBV Hepadnaviren 45nm mit Hülle circ DNA, 3.2kb 8 (A-H) ja HCV Flaviviren 50-60nm mit Hülle ss(+) RNA, 9.5kb 6 (1-6) ja HDV Deltavirus 35nm mit Hülle circ.ss RNA 1.8kb 3 (I-III) ja HEV Caliciviren 30nm ohne Hülle ss(+) RNA, 7.2kb 1 Serotyp nein HGV Flaviviren 40-50nm mit Hülle ss(+) RNA, 9.5kb 1 ja
3 Erreger der viralen Hepatitis (n=8803) (Deutschland, 2007) HCV (77,9%)* HAV (10,6%) HBV (11,5%) * Meldepflicht für alle Nachweise, soweit nicht bekannt ist, dass eine chronische Infektion vorliegt ( 7 IfSG)
4 Prävalenz (aktuell infizierte Menschen):? Chronische Hepatitis B: geographische Verbreitung
5 Prävalenz (aktuell infizierte Menschen): 350 Mill. Chronische Hepatitis B: geographische Verbreitung
6 Prävalenz (aktuell infizierte Menschen):? Hepatitis C: Verbreitung
7 Prävalenz (aktuell infizierte Menschen): Mill. Hepatitis C: Verbreitung
8 Hepatitis B: Infektionswege (USA, 1993) IVDA (15%) homosexuelle Kontakte (9%) heterosexuelle Kontakte (41%) unbekannt (31%) Haushaltskontakte (2%) andere (1%) medizinisches Personal (1%)
9 HCV: Risikofaktoren (USA, ) Haushaltskontakt (3%) med.pers. (4%) Transfus. (4%) multiple RF (14%) unbekannt (1%) Sexualkontakt (14%) IVDA (59%)
10 Inzidenz (weltweit): 1.4 Millionen (WHO, geschätzt) Hepatitis A: Verbreitung
11 Hepatitis A Verlauf Infektion Ikterus HAV-RNA/Antigen (Stuhl) HAV-RNA (Serum) Anti-HAV-IgG Anti-HAV-IgM Wochen Jilg, 2006
12 Nachweisverfahren Direkte Methoden - Elektronenmikroskopie - Nachweis viraler Antigene - Nachweis viraler Nukleinsäuren Indirekte Methoden - IgG/IgM Antikörper (EIAs, Westernblots)
13 HBV: EM-Bild aus dem Serum Dane-Partikel HBsAg (zirkulär) HBsAg (filamentös)
14 HBV: Aufbau (Dane-Partikel) Hülle (HBsAg) Kapsid (HBcAg) HBV-DNA DNA-Polymerase
15 HBV Genomstruktur
16 HBV: Serologischer Verlauf Klinik HBsAg HBeAg Anti-HBc Anti-HBc-IgM Anti-HBs Anti-HBe Jahre Wochen nach Exposition
17 HBs Antigen Test MEIA, Abbott Axsym Magnetpartikel Anti HBs beschichtet HBs Antigen AP-konjugierter Anti HBsAK Y Y Y Y Y Fluoreszenz signal Magnetische Separation Y Y Substratlösung Y Y Magnet
18 MVZ Mikrobiologie & UKE Akute Hepatitis B? HBsAg (AP) ahbs ahbc ahbc (IgM) HBeAg ahbe HBV- DNA akute Hepatitis B Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø
19 HBsAg (AP) MVZ Mikrobiologie & UKE Akute Hepatitis B? (oder: es gibt mehr als Schwarz und Weiß) (Teil 1) HBsAg (OPD) ahbs ahbc ahbc (IgM) HBeAg ahbe HBV- DNA akute Hepatitis B >200 > Ø Ø Ø Ø 14 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø 22 Ø Ø Ø Ø Ø Ø 11 Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Antikörper gegen Alkalische Phosphatase? 4 Ø
20 MVZ Mikrobiologie & UKE Akute Hepatitis B? (Teil 2) HBsAg HBsAg ahbc (AP) (OPD) ahbs ahbc (IgM) HBeAg ahbe HBV- DNA >200 > Ø Ø Ø Ø 1x Ø Ø Ø 12 Ø 1x Ø Ø Ø Ø 8x Ø Ø Ø Ø 1x Ø Ø Ø Akute Hepatitis B bei Immunsuppression!!! 11 Ø 4x10 6
21 HBV DNA Nachweisverfahren Hybridisierungstests Southern, Northern Blot Hybridisierung Hybrid Capture Test Amplifikationstests PCR NASBA branched DNA
22 Prinzip der Hybridisierung RNA Sonde 5 -AACGUGUCCAGUACUGCCUGUCAAAAA-3 5 -CAGGTCATGACG-3 Sonde DNA DNA 5 -CAGGTCATGACG-3 5 -AACGTGTCCAGTACTGCCTGACA-3 3 -TTGCACAGGTCATGACGGACTGT-5
23 Hybridisierung mit nicht-radioaktiv markierten Sonden
24 Sensitivität molekularer Nachweisverfahren Antigen Test (HIV p24 EIA) Nukleinsäure Hybridisierung In vitro Amplifikation (PCR) Anzahl der Erreger
25 Polymerase-Kettenreaktion Prinzip Denaturierung Annealing C C Reaktionsmix: DNA-Template (z.b. genomische DNA) Primer 1 Primer 2 dntps: datp, dctp, dgtp, dttp Mg 2+ PCR Puffer DNA Polymerase (thermostabil) Extension C
26 Polymerase Chain Reaction (PCR)
27 Polymerase-Kettenreaktion Prinzip > 10 6 fache Vervielfältigung der Zielsequenz
28 Sensitivität der HBV Amplifikationstests Methodik Nachweis- linearer Messbereich grenze Real Time PCR Roche (Cobas TaqMan) 12 U/ml U/ml Abbott (RealTime HBV) 10 U/ml U/ml b DNA (Siemens, Versant HBV) 360 U/ml 360-2x10 8 U/ml Hybrid Capture (Qiagen/Digene) 3500 U/ml x10 8 U/ml
29 PCR in der HBV Diagnostik - Abklärung unklarer serologischer Befunde Grenzwertiges HBs Antigen Persistierende HBs Antigen Reaktion ohne AK Bildung Verdacht auf HBV Infektion bei negativem HBs Antigen (akute Infektion, okkulte Infektion, HBs Antigenvarianten) - Bestimmung der viralen Replikationsaktivität/Infektösität - Prognostische Abklärung chronischer HBV Infektion - Initiierung und Monitoring der antiviralen Therapie - Charakterisierung von Virusisolaten (Genotyp, Resistenzund Virulenz-assoziierte Mutationen/Polymorphismen)
30 Isoliertes anti-hbc Jahre nach abgelaufener Hepatitis B? (1 Dosis Hepatitis-B-Impfstoff Boosterung des anti-hbs) unspezifisch? (anderer Test, Verdünnung von 1:2) latenter Virusträger? (hoher anti-hbc-titer, HBV-DNA (PCR)) 1% haben HBV-DNA > 100 Kopien/ml
31 Isoliertes anti-hbc Extinktion (MEIA): 0,88 (positiv: < 1,0; spezifische Reaktivitäten: < 0,1) 1:2: negativ, ELISA anti-hbc: negativ, anti-hbe: negativ, PCR: negativ
32 MVZ Mikrobiologie & UKE Hepatitis B nach LTx oder: Wie ausgeheilt ist eine ausgeheilte Hepatitis B? (* 09/90, LTx 12/91) HBsAg anti-hbs HBsAg (µg/ml) LTx Re-LTx anti-hbs (miu/ml) Lebersegment des Vaters: HBsAg neg., anti-hbs pos., anti-hbc pos., HBV-DNA negativ (NWG: 2x10 5 Kopien/ml)
33 Antivirale Therapie (HBV) Indikation HBV DNA > 10 4 copies/ml (2000 U/ml) (insbesondere bei erhöhten Transaminasen, Leberfibrose oder Zirrhose) Monitoring VL-Kontrolle nach 6w, 12w und dann in 3-6 Monats Intervallen Ziel: VL < 2000U/ml, idealerweise unter die Nachweisgrenze >10x Anstieg der VL: Hinweis auf Therapieversagen - Compliance - Pharmakologische Faktoren - Resistenzentwicklung
34 Resistenzmutationen V84M/ S85A L180M A181V/T T184G/S S202I M204V/I V214A/ Q215S N236T M250V 3TC ADV ETV TBV FTC TDF
35 HBV Resistenzanalyse pol HBV-Polymerase PCR 204 Y M D D AATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTATATA Sequenzanalyse HBV-Referenzsequenz HBV-Patientenisolat Internet-Datenabgleich HIV-GRADE, HBV tool Geno-2 pheno, HBV M204V Identifizierung und Interpretation der Resistenz-assoziierten Mutationen
36 HBV-Resistenzmutationen quantitative Aussagen HBV 3TC ADV ETV Clevudine Telbivudine WT L180M > M204I > > L180M+ M204V > > A181T/V NA NA NA N236T I169T/ M250V > NA >100 >1000 T184G/ S202I > NA >1000 >1000 Chin 2001, Angus 2004, Levine 2002, Tenny 2004, Ono-Nits 2002
37 3TC-Resistenz
38 Adefovir-Resistenz
39 1989 identifiziert (Non-A-Non-B-Hepatitiden) Einzelsträngiges RNS-Virus mit Lipoproteinhülle Gehört zur Gruppe der Flaviviren Durchmesser nm Hohe Chronizität 6 Genotypen (keine Unterschiede bzgl. Virulenz) Hepatitis-C Virus
40 Hepatitis C Serologischer und klinischer Verlauf Chronisch-aktive Hepatitis Akute Hepatitis Klinik Zirrhose HCC GPT (U/l) HCV-Antikörper (ELISA) HCV-RNA (RT-PCR) Wochen Monate Jahre Jahrzehnte *Polywka, 2002
41 HCV-Diagnostik Antikörpersuchtest Bestätigungstest (Blot, Matrix) HCV-PCR (Genotypisierung)
42 MVZ Mikrobiologie & UKE Gutachten berufsgenossenschaftlich anerkannte berufsbedingte chronische Hepatitis C keine Therapie Suchtest: positiv Blot: negativ PCR: negativ
43 MVZ Mikrobiologie & UKE Spezifität der Reaktivität im Antikörpersuchtest (n=2148) fraglich reaktiv (1,2%) falsch positiv (13,2%) bestätigt positiv (85,6%)
44 MVZ Mikrobiologie & UKE Spezifität der Antikörperreaktivität (n=2148) falsch positiv fraglich bestätigt positiv > 40 (S/CO)
45 Pat. A., M.,, *1955) Datum Antikörper PCR Genotyp (IU/ml) negativ x10 4 4a x10 4 4a
46 HCV bei Dialysepatienten (n=1774) chronische HCV-Inf. (9,8%) akute HCV-Inf. (1,4%) (n=25) 9 PCR u. AK pos. 16 verzögerte AK-Bildung HCV-negativ (88,9%)
47 Verlauf der chronischen HCV-Infektion HCV-Antikörper (S/CO) Nachweisgrenze HCV-RNA (log 10 IU/ml)
48 Geographische Verteilung der HCV-Genotypen 1a (60%) 1b (20%) 2a, 2b, 3a 1a, 1b, 3a 4a (90%) 3a 1b, 2a, 2b 6 1b, 2 1a, 1b, 2, 3a 5 1, 2, 3
49 Verteilung der HCV- Genotypen in Hamburg 3a (2%) 4a (3%) 4a (4%) 1b (48%) 1a (46%) 2 (3%) 3a (16%) 1b (50%) 1a (28%) (n=447) (n=747)
50 HCV Genotypisierung Bedeutung der Genotypisierung - Unterschiedliches Ansprechen auf eine antivirale Behandlung - Unterschiedliche Dauer der antiviralen Behandlung
51 HCV Genotypisierung Durchführung reverse Hybridisierung (LiPA; line probe assay)
52 HCV Genotypisierung Durchführung reverse Hybridisierung (LiPA; line probe assay) Versant, InnoLiPA HCVII, Bayer/Siemens
53 6 Monate nach Therapie anhaltender Therapieerfolg = Viruselimination? HCV-Antikörper (S/CO) peg IFNα + Riba HCV-RNA (log 10 IU/ml) Jahre
54 Hepatitis Diagnostik Zusammenfassung Chronische Virushepatitis durch HBV und HCV: in Deutschland ca. 0.6% (~ ) chronische HBV Infektion ca. 0.4% (~ ) chronische HCV Infektion Basis Diagnostik: HBV: Serologie (HBsAg, HBs AK, HBc AK) HCV: AK-Test (in kürze AK/Ag-Test) Molekularbiologische Verfahren (PCR) Virusaktivität, Infektiösität, prognostische Abklärung Therapieindikation und Monitoring Charakterisierung der Viren (Genotyp, Virulenz, Resistenz)
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