Genisolierung in 2 Stunden : Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Transkript

1 PCR

2 Genisolierung in 2 Stunden : Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) von Kary B. Mullis entwickelt (1985) eigentlich im Mai 1983 bei einer nächtlichen Autofahrt erstes erfolgreiches Experiment am Nobelpreis für Chemie 1993

3 Kary B. Mullis Nobelpreis surfer and scientist...

4 Kleppe et al. (1971) J. Mol. Biol. 56:341

5 Prinzip der PCR Vervielfältigung der DNA-Abschnitte nach dem Prinzip der Replikation

6 Der PCR-Zyklus 1. Denaturierung (94-98 C, 1-60 sec) 2. Primerbindung (50-65 C, 1-60 sec), ca. 5 C unter Tm der Primer 3. DNA-Synthese (72 C, 1 sec bis 12 min u.mehr)

7 Minimale Sequenzinformation für die PCR: Beiderseits des zu amplifizierenden Abschnitts müssen kurze Sequenzabschnitte bereits bekannt sein, um dort die Bindung definierter Primer zu ermöglichen!

8 PCR Polymerase Kettenreaktion 3 -GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5 5 -CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3 3 -GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5 TTCGA GATCG 5 -CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3

9 PCR Polymerase Kettenreaktion 3 -GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCCGGTA-5 TTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT GGCCTTAAGCTAGTTTTAAACCGATCG 5 -CCGGAATTCGATCAAAATTTGGCTAGGCCAT-3

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11 Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz Zyklen sinnvoll

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13 Praktische Hinweise zum Primerdesign 18-25mere, 40-60% GC, gut gemischte Sequenz keine Teile von Repeats: Spezifität über Datenbanksuchen überprüfen 3 Ende bevorzugt ein G od. C keine 3 End-Komplementarität der zwei Primer! (sonst u.u. Primer-Dimer-Bildung) keine internen Homopolymer-Runs (>4) oder simple sequences keine internen Inverted repeats (>3 Nt im Stamm)

14 Schmelztemperatur von Primer T m = 4 * ( Anzahl G+C) + 2 * ( Anzahl A+T)

15 Polymerase Zunächst: Klenow-Fragment der DNA- Polymerase aus E. coli thermolabil, d.h. Zugabe nach jedem Zyklus Reaktion sehr aufwendig und teuer Hybridisierung und Polymerisation bei 37 C Folge: durch Fehlhybridisierung der Primer viele Nebenprodukte Produktlänge auf 200 Bp beschränkt

16 Taq DNA Polymerase aus Thermus aquaticus T. aquaticus Stamm YT-1, gesammelt von T. Brock 1967 im Yellowstone Natl. Park 892 As, 94 kd ph opt. 8,3-8,8 prozessiv : 60 Nt/sec bei 72 C; 1,5Nt/sec bei 37 C > 1kb pro Minute synthetisiert keine proofreading Aktivität!

17 Eigenschaften thermostabiler Polymerasen

18 Mutationsraten verschiedener hitzestabiler DNA-Polymerasen Taq Vent Pfu 1, x 10-6 Ca. 1 Fehler pro 1 kb - Molekül nach 35 Zyklen

19 ...weitere experimentelle Bedingungen Primerkonzentration: ca. 0,5µM; d.h. bis Moleküle Matrize: 0,1-1 µg Genom-DNA; 10 ng Plasmid dntps: 200 µm Endkonz. (genug für 6 µg DNA) Denaturierung: C (abhängig von Matrize+Enzym) Annealing: 5 bis 10 C niedriger als Tm des Templates (meist: C) Extension: ca. 1 min pro kb

20 Spielarten der PCR XL-PCR Nested-PCR RT-PCR (Reverse Transkriptase + PCR) Quantitative PCR klassisch oder real-time RT-PCR Quantitative PCR RACE (rapid amplification of cdna ends) inverse PCR (PCR von flankierenden Regionen) In situ PCR Mutagenese und Nachweis von bekannter Punktmutationen Sondenherstellung

21 RT-PCR 1. Schritt: Reverse Transkription von mrna, es entsteht sogenannte cdna (complementary DNA) 2. Schritt: PCR Zielsetzung: welches Gen ist in einer bestimmten Zelle aktiv

22 Quantitative PCR eine Methode zur Quantifizierung der Ausgangsmenge an Template in einer Lösung Voraussetzung : während der exponentiellen Phase der Amplifikation verläuft die DNA- Vermehrung linear

23 Exponentielle Vermehrung der Zielsequenz Zyklen sinnvoll

24 Quantitative PCR Prinzip: Vergleich zu einem Standard-DNA- Molekül

25 Real-Time PCR

26 Quantitative PCR Hauptanwendung: Quantifizierung von mrna z.b. zum Vergleich von Genexpressionsraten in verschiedenen Geweben (z.b. zwischen gesunden und pathogenen Gewebeproben)

27 Race - rapid amplification of cdna ends Ziel: Vervollständigung der 5 bzw. 3 Ende von cdna-klonen

28 Inverse PCR

29 Long range / XL - PCR herkömmliche Taq Pol amplifiziert nur ineffizient Moleküle größer 5-6 kb Grund: sich akkumulierende Fehleinbauten am 3 OH- Ende können nicht entfernt werden und verhindern weitere Polymerisierung Lösung: Kombination einer prozessiven Taq Pol mit anderer thermostabiler Pol mit proof-reading-funktion > ermöglicht Amplifikation von bis zu > 20 kb

30 weitere PCR- basierende Methoden LM-PCR (Ligation-mediated PCR unter Verwendung anligierter Linker) multiplex PCR (mehrere Amplikons parallel) Nested PCR hotstart PCR (verbessert Spezifität)...und sehr viele mehr...

31 Anwendungen der PCR Medizinische und mikrobiol. Diagnostik Herstellung von Genbanken aus limitierendem Material Isolierung von Transkripten (RT-PCR) Bestimmung von Transkriptionsstart/endpunkten Isolierung von DNA-Abschnitten Quantifizierung von DNA und RNA ancient DNA Mutagenese von DNA-Molekülen Markierung von Sonden für die Hybridisierung Etc...

32 PCR in der Nahrungsmitteldiagnostik

33 Schwein-DNA Negativ-K. Rind-DNA Rind B4 Marker Lyoner 910 Bp 659 Bp 521 Bp 403 Bp 281 Bp 257 Bp 226 Bp

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35 PCR-Ansatz auf Eis pipettieren!: 1 µl genomische DNA (ca ng) 5 µl 10x PCR-Puffer 1 µl 10 mm dntp-mix (datp, dctp, dttp, dgtp) 1 µl Primer 1 (10 pmol/µl) 1 µl Primer 2 (10 pmol/µl) 40 µl A. bidest 1 µl Taq-(DNA)-Polymerase (1-2,5 U) 50 µl Gesamtvolumen mischen, kurz anzentrifugieren, zurück auf Eis

36 PCR-Programm 1. Denaturierung 94 C 120 sec 1x 2. Denaturierung 94 C 30 sec 3. Annealing 55 C 30 sec 35x 4. Elongation 72 C 90 sec 5. finale Elongation72 C 6 min 1x 4 C