Etablierung, Validierung und praktische Anwendung einer multiplex real-time RT-PCR zum Nachweis des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

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1 Aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Virusdiagnostik des Friedrich-Loeffler-Instituts, Insel Riems Etablierung, Validierung und praktische Anwendung einer multiplex real-time RT-PCR zum Nachweis des Rabbit Haemorrhagic Disease Virus INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Astrid Gall aus Ibbenbüren t Hannover 2006

2 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 11 2 LITERATURÜBERSICHT Die Rabbit Haemorrhagic Disease Ätiologie / Das Rabbit Haemorrhagic Disease Virus Taxonomie Morphologie und physikalische Eigenschaften Genomorganisation und Proteine Klinik, Pathologie und Pathogenese Epidemiologie und Bekämpfung Laboratoriumsdiagnose Indirekter Erregernachweis Direkter Erregernachweis Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion Einleitung Detektionssysteme Detektionssysteme ohne Zuwachs an Spezifität Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität Datenanalyse Quantifizierung Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Multiplex real-time PCR Interne Kontrollen 40

3 INHALTSVERZEICHNIS 3 MATERIAL UND METHODEN Virusstämme RNA-Isolierung Allgemeines RNA-Isolierung mit dem RNeasy Mini Kit RNA-Isolierung mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit RNA-Isolierung mit TRIzol Reagent Klonierung und in vöro-transkription Allgemeines Herstellung einer positiven Kontrolle für die real-time RT-PCR Amplifizierung mittels RT-PCR Klonierung In vifro-transkription Herstellung einer positiven Kontrolle für die Formaldehyd- Agarosegelelektrophorese und den Northern Blot Herstellung der RNA-Sonden für den Northern Blot und die In situ- Hybridisierung Real-time RT-PCR Auswahl von Primern und Sonden Reaktionsbedingungen Konventionelle RT-PCR Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA Agarosegelelektrophorese (für DNA) Formaldehyd-Agarosegelektrophorese (für RNA) Dot Blot und Northern Blot 59

4 3.7 Antigen-ELISA Antikörper-ELISA Zellen und Zellkulturtechnik Infektion und Transfektion Indirekter Immunfluoreszenztest Hämagglutinationstest Viruskonzentrierung Histologie und Immunhistologie In sitw-hybridisierung Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren Untersuchungen zum carrier-statiis von immunisierten Tieren nach c/tal/enge-infektion Untersuchungen zur in vilro-replikation nach Infektion und Transfektion 70 4 ERGEBNISSE Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV Primer-und Sondendesign Optimierung der Reaktionsbedingungen Herstellung einer positiven Kontrolle und externer RNA-Standards Sensitivität Analytische Sensitivität Sensitivität des Single und multiplex real-time RT-PCR assays 74

5 INHALTSVERZEICHNIS Sensitivität im Vergleich zur konventionellen RT-PCR Sensitivität im Vergleich zum Antigen-ELISA Spezifität Untersuchungen zur Viruspersistenz in rekonvaleszenten Tieren Klinik und Pathologie Detektion von Antikörpern Verteilung der Virusgenomlast und Charakterisierung der isolierten RNA Detektion von Antigen oder infektiösem Virus Untersuchungen zum camer-status von immunisierten Tieren nach cftawwige-infektion Detektion von Antikörpern Verteilung der Virusgenomlast Kinetik von Replikationsvorgängen in vitro Kinetik nach Infektion Kinetik nach Transfektion 92 5 DISKUSSION Etablierung einer multiplex real-time RT-PCR für RHDV Nachweis der Persistenz von Virusgenom in rekonvaleszenten sowie immunisierten und danach feldvirusexponierten Kaninchen Kinetik von Replikationsvorgängen des RHDV in vitro ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY 107

6 8 LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Material Virusstämme Zellen und Bakterienstämme Versuchstiere Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards Enzyme Kommerziell erhältliche Systeme Antigene, Antikörper und Konjugate Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser RNA-Isolierung, PCR Klonierung und in virro-transkription Agarosegelelektrophorese, Membrantransfer von RNA ELISA Zellkultur, Hämagglutinationstest, Viruskonzentrierung Pathohistologie, Immunhistologie, In.sifa-Hybridisierung Sonstige Reagentien Geräte und Gebrauchsgegenstände Verbrauchsmaterialien Software Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis AbkUrzungsverzeichnis 155