Frühe Apoptose Zeit nach Bestrahlung [h]

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1 1.1 APOPTOSE-NACHWEIS BEI LYMPHOZYTEN UND BEI TUMORZELLINIEN FRAGESTELLUNG Die folgenden Untersuchungen sollten zum einen klären, inwieweit bei Normalspender-Lymphozyten und bei 4 Tumorzellinien konstitutive Apoptose sowie Apoptose nach Röntgenbestrahlung (strahleninduzierte Apoptose) nachweisbar ist. Zum anderen sollte untersucht werden, ob die Apoptosefähigkeit im Zusammenhang mit dem Zelltyp oder dem p53-status steht. Insbesondere sollten die unterschiedlichen Apoptosefähigkeiten von Tumorzellinien mit denjenigen von Normalspender-Lymphozyten verglichen werden. Zum Nachweis früh apoptotischer Zellen und spät apoptotischer/nekrotischer Zellen wurde die Annexin-5-Methode angewandt ERGEBNISSE Apoptose bei Lymphozyten bestimmt mit der Annexin-5 Methode Im ersten Diagramm ist der prozentuale Anteil früh apoptotischer Zellen und im zweiten Diagramm der Anteil spät apoptotischer/nekrotischer Zellen nach 4Gy Röntgenstrahlen bei Normalspender- Lymphozyten dargestellt. 35 Frühe Apoptose 30 Anteil der Zellen [%] Kontrolle 4Gy Röntgenstrahlen Zeit nach Bestrahlung [h] Abbildung 1: Frühe Apoptose nach 4Gy Röntgenstrahlen bei Lymphozyten. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten.

2 Späte Apoptose und Nekrose Anteil der Zellen [%] Kontrolle 4Gy Röntgenstrahlen Zeit nach Bestrahlung [h] Abbildung 2: Späte Apoptose und Nekrose nach 4Gy Röntgenstrahlen bei Lymphozyten. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Die abgebildeten Diagramme zeigen, daß bei Normalspender-Lymphozyten sowohl der Anteil der konstitutiven früh apoptotischen Zellen als auch der Anteil der konstitutiven spät apoptotischen/nekrotischen Zellen mit der Zeit zunimmt. Weiterhin legen diese Ergebnisse dar, daß die Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen zu einer Erhöhung des Anteils früh apoptotischer Zellen wie auch des Anteils spät apoptotischer/nekrotischer Zellen (strahleninduzierte Apoptose) führt Apoptose bei Tumorzellinien bestimmt mit der Annexin-5-Methode Das folgende Diagramm zeigt den konstitutiven und strahleninduzierten Anteil (nach 4Gy Röntgenstrahlen) früh apoptotischer Zellen bei 2 Plattenepithelkarzinom-Zellinien (4197 und 4451) und bei 2 Melanom-Zellinien (Be11 und Mewo). P-Werte und Zahlenverhältnisse zu dem Vergleich zwischen konstitutiver und strahleninduzierter früher Apoptose sind daran anschließend in tabellarischer Form wieder gegeben.

3 6 Frühe Apoptose konstitutiv strahleninduziert Apoptotische Zellen [%] Zellinie Abbildung 3: Frühe Apoptose bei Tumorzellinien nach Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlung und 48 Stunden Kultur. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Strahleninduzierte frühe Apoptose p-wert 0,06 0,04 0,04 0,11 Zahlenverhältnis ratio 1,88 1,63 1,40 1,26 Tabelle 1: P-Werte und Zahlenverhältnisse zum Vergleich zwischen konstitutiver und strahleninduzierter früher Apoptose bei 4 Tumorzellinien nach 4Gy Röntgenstrahlung. Das nachstehende Diagramm gibt den konstitutiven und strahleninduzierten Anteil spät apoptotischer/nekrotischer Zellen bei den zuvor genannten 4 Tumorzellinien wieder. P-Werte und Zahlenverhältnisse zu dem Vergleich zwischen konstitutiver und strahleninduzierter später Apoptose / Nekrose sind danach in tabellarischer Form wieder gegeben.

4 12 10 konstitutiv strahleninduziert Späte Apoptose und Nekrose Apoptotische Zellen [%] Zellinie Abbildung 4: Späte Apoptose und Nekrose bei Tumorzellinien nach 4Gy Röntgenstrahlen und 48 Stunden Kultur. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Strahleninduzierte späte Apoptose und Nekrose p-wert 0,14 0,15 0,28 0,11 Zahlenverhältnis ratio 1,25 1,22 1,17 1,34 Tabelle 2: P-Werte und Zahlenverhältnisse zum Vergleich zwischen konstitutiver und strahleninduzierter früher Apoptose bei 4 Tumorzellinien nach 4Gy Röntgenstrahlung. Der Anteil früh apoptotischer und spät apoptotischer/nekrotischer Zellen ist bei den 4 hier untersuchten Zellinien geringer als bei Normalspender-Lymphozyten. Diese Apoptose-Bestimmungen mit der Annexin-5-Methode zeigen zudem, daß nach einer Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen bei den Zellinien 4197 (p=0,06), 4451 (p<0,05) und Be11 (p<0,05) der Anteil früh apoptotischer Zellen erhöht ist (strahleninduzierte frühe Apoptose). Das größte Zahlenverhältnis (Ratio) zwischen strahleninduzierter und konstitutiver früher Apoptose wird für die Zellinie 4197 erhalten (1,88). Die Analyse der spät apoptotischen/nekrotischen Zellen zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen konstitutiver und strahleninduzierter Apoptose (P-Werte zwischen 0,11 und 0,28) DISKUSSION Die Apoptosefähigkeit verschiedener Zelltypen ist sehr unterschiedlich. Tumoren des hämatopoetischen Systems erweisen sich eher als apoptosesensitiv ( i ). Dagegen sind die meisten Sarkome und Melanome als apoptoseresistent zu bezeichnen ( ii ). Yamada und Ohyama konnten schon

5 1988 zeigen, daß der strahleninduzierte Interphasetod von Thymozyten der Ratte ein Beispiel für einen apoptotischen Zelltod ist ( iii ). Die hier untersuchten Normalspender-Lymphozyten zeigen ebenfalls, nachgewiesen mit der Annexin-5-Methode, einen großen Anteil apoptotischer Zellen. Methodisch bedingt kann bei den Annexin-5 positiven sowie Propidiumjodid positiven Zellen (A5+PJ+) zwischen spät apoptotischen und nekrotischen nicht unterschieden werden. Stimmt die Annahme, daß Zellen des hämatopoetischen Systems nach Bestrahlung einen apoptotischen Zelltod sterben, so sind die A5+PJ+ Zellen in diesem Fall als spät apoptotisch zu bezeichnen und der Anteil nekrotischer Zellen ist vergleichsweise gering. Dagegen haben Payne et al. (1992) an humanen Lymphozyten zeigen können, daß im Gegensatz zum Zeitpunkt 4 Stunden nach Bestrahlung zum Zeitpunkt 16 Stunden nach Bestrahlung neben dem apoptotischen Zelltod auch Nekrose zu beobachten ist ( iv ). Weiterhin wiesen Payne et al. (1992) darauf hin, daß zu diesem 16 Stunden Zeitpunkt nicht nur die klassischen Formen des Zelltods (Nekrose und Apoptose) auftreten, sondern zudem eine als kombinierte Apoptose/Nekrose bezeichnete Form, die als sekundäre Nekrose apoptotischer Zellen interpretiert wird. Dieses, noch nicht genau charakterisierte Stadium der späten Apoptose kann in der Zellkultur nicht wie apoptotische Zellen in vivo von Makrophagen phagozytiert werden und muß zwangsläufig einen anderen Weg der Elimination nehmen. Ergänzend soll die Tatsache erwähnt werden, daß die hier untersuchten Lymphozyten alle mikroskopisch, kontrolliert vor und nach der Annexin-5 Markierung, intakt waren. Somit ist anzunehmen, daß der Anteil an nekrotischen Zellen während der 45 Minuten dauernden Markierung vernachlässigbar gering sein dürfte und daher primär die Apoptose als Form des Zelltods gemessen wurde. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die benutzten Zelltypen sich deutlich in ihrer Apoptosefähigkeit unterscheiden. Im Vergleich zum Anteil apoptotischer Zellen bei Normalspender-Lymphozyten ist der Anteil der apoptotischen Zellen bei den untersuchten vier Zellinien deutlich geringer. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei den 4 hier untersuchten Tumorzellinien nach 4Gy Röntgenstrahlung eine Induktion der strahleninduzierten Apoptose nachweisbar ist. Die Unterschiede zwischen konstitutiver und strahleninduzierter früher Apoptose sind, ausgehend von einem 5%-igem Signifikanzniveau, bei den Zellinien 4451 und Be11 signifikant. Betrachtet man die Unterschiede zwischen konstitutiver und strahleninduzierter später Apoptose/Nekrose, so sind diese bei gleichem Signifikanzniveau mit p-werten zwischen 0,11 und 0,28 nicht als signifikant zu bezeichnen. Die bestimmten Zahlenverhältnisse für den Vergleich zwischen strahleninduzierter und konstitutiver Apoptose geben aber auch Auskunft über die Fähigkeit zur Apoptose-Induktion. Hier gilt sowohl für die frühe Apoptose als auch für die späte Apoptose/Nekrose bei den Plattenepithelkarzinom-Zellinien, daß die Zellinie mit p53-wildtyp (4197) einen höheren Ratio -Wert erbringt als die Zellinie mit mutiertem p53-protein (4451). Dies ist ebenfalls beim Vergleich der beiden Melanomzellinien (p53- Wildtyp Be11 im Vergleich mit p53-mutante Mewo) im Bezug auf die frühe Apoptose der Fall. Somit

6 scheint bei den hier untersuchten Zelltypen ein Zusammenhang zwischen dem p53-status und der Apoptosefähigkeit zu bestehen. Die p53-wildtypzellinien 4197 und Be11 sind im Vergleich zu den Zellinien 4451 und Mewo effektiver zur Induktion der Apoptose befähigt. Dem guardian of the genome Konzept von Lane et al. (1992) entsprechend ist auch hier mutiertes p53 im Vergleich zu funktionsfähigem p53-protein weniger in der Lage die Apoptose zu induzieren und auf diese Weise geschädigte Zellen zu eliminieren (6). In einer Reihe von Systemen konnte bisher eine p53-abhängige Apoptoseinduktion und eine Zellzyklusarretierung nachgewiesen werden ( v, vi ). Ebenso existieren aber auch Hinweise dahingehend, daß Apoptose und G 1 -Block separate Funktionen des p53-proteins repräsentieren, wie in einer Arbeit von Lin und Benchimol (1995) gezeigt ( vii ). In dieser Arbeit wird dokumentiert, daß eine p53- Stimulierung mit Erythropoetin in verschiedenen Zellklonen entweder zur Induktion der p53- abhängigen Apoptose oder zur G 1 -Phase-Arretierung führt. Eine gänzlich vom p53-protein unabhängige strahleninduzierte Apoptoseinduktion wird unter anderem in den Arbeiten von Haas- Kogan et al. (1995, 1996) beschrieben ( viii, ix ). Zum Beispiel zeigen Haas-Kogan et al. (1996) an Glioblastomzellen, daß nach einer Inaktivierung der p53-wildtypfunktion durch eine dominant negative Mutantenfunktion keine Veränderung der zellulären Anfälligkeit für eine strahleninduzierte Apoptose zu beobachten ist. Auch bietet sich eine funktionelle Verknüpfung zwischen Apoptose und Zellzyklusblockierung, vermittelt über das p53-protein, als Erklärung an. Die sogenannte Clash -Hypothese hat zum Inhalt, daß gerade widersprüchliche Signale in der Zelle, wie zum Beispiel das Signal zum Verlassen der G 1 -Phase und das Signal nicht reparierter Schäden oder das Signal zum Verlassen der G 2 -Phase und das Signal nicht reparierter Schäden, für die strahleninduzierte Apoptose verantwortlich sind ( x ). In einer solchen Situationen, wenn Signale die das Voranschreiten im Zellzyklus induzieren sollen, vorhanden sind und gleichzeitg geschädigte DNA in der Zelle vorliegt, bleibt der Zelle vermutlich nur noch der Weg der Apoptose-Induktion. Diese geschädigte DNA kann zu einem DNA sein, deren Schäden zu stark sind. Zum anderen kann sie eine geschädigte DNA sein, deren Reparatur mißlungen ist. In einer Arbeit von Abend und van Beuningen (1998) wird der Zusammenhang zwischen erhöhter Apoptoseempfindlichkeit und erhöhter Strahlenempfindlichkeit vermutet ( xi ). Ein solcher Zusammenhang wird auch von anderen Autoren vermutet, die beobachten, daß p53-wildtypzellen häufig strahlensensitiv sind, einen strahleninduzierten G 1 -Block und eine strahleninduzierte Apoptose zeigen (Fehler! Textmarke nicht definiert.). Diese Autoren deuten das so, daß die erhöhte Empfindlichkeit auf die induzierte Apoptose zurückzuführen ist. Untersuchungen von Zölzer et al. (1997) aus unserem eigenen Institut zeigen aber, daß den beiden p53-wildtypzellinien (4197 und Be11) die Fähigkeit zur G 1 -Phaseblockierung und eine im Vergleich zu den Zellinien mit mutiertem p53-protein höhere Strahlenresistenz zu eigen ist (62). Gleichzeitig

7 sind es die p53-wildtypzellinien, die eine größere Neigung zur strahleninduzierten Apoptose zeigen, so daß man davon ausgehen kann, daß eine erhöhte Apoptose-Neigung nicht in jedem Fall mit einer höheren Strahlenempfindlichkeit einher geht. i. Meyn R.E., Stephens L.C., Voehringer D.W., Story M.D., Mirkovic N. und Milas L. Biochemical modulation of radiation-induced apoptosis in murine lymphoma cells. Radiat. Res. 136, , 1993 ii. Falkvoll K.H. The occurrence of apoptosis, abnormal mitoses, cells dying in mitosis and micronuclei in human melanoma xenograft exposed to single dose irradiation. Strahlenther. Onkol. 166, , 1990 iii. Yamada T. und Ohyama H. Radiation-induced interphase death of rat thymocytes is internally programmed (apoptosis). Int. J. Radiat. Biol. 53, 65-75, 1988 iv. Payne C.M., Bjore C.G. und Schultz D.A. Change in the frequency of apoptosis after low- and highdose X-irradiation of human. J. Leukoc. Biol. 52, , 1992 v. Gotz C. und Montenarh M. P53 and its implications in apoptosis. Int. J. Oncol. 6, , 1995 vi. Wilson J.W., Pritchard D.M., Hickman J.A. und Potten C.S. Radiation-induced p53 and p21waf- 1/CIP1 expression in the murine intestinal epithelium: apoptosis and cell cycle arrest. Am. J. Pathol. 153, , 1998 vii. Lin Y. und Benchimol S. Cytokines inhibit p53-mediated apoptosis but not p53-mediated G1 arrest. Mol. Cell Biol. 15, , 1995 viii. Dee S., Haas-Kogan D.A. und Israel M.A. Inactivation of p53 associated with decreased levels of radiation -induced apoptosis in medulloblastoma cell lines. Cell Death Different. 2, , 1995 ix. Haas-Kogan D.A., Yount G., Haas M., Levi D., Kogan S.S., Hu L., Vidair C., Deen D.F., Dewey W.C. und Israel M.A. P53-dependent G1 arrest and p53-independent apoptosis influence the radiobiologic response of glioblastoma. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 36, , 1996 x. Rubin L.L., Philpott K.L. und Brooks S.F. The cell cycle and cell death. Curr. Biol. 3, , 1993 xi. Abend M. und van Beuningen D. Bedeutung apoptotischer Prozesse für die Strahlentherapie. Strahlenther. Onkol. 174, , 1998