Transkriptionelle Repression als molekulare Grundlage der anti-inflammatorischen Wirkung von Glucocorticoiden

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1 Forschungszentrum Karlsruhe Technik und Umwelt Wissenschaftliche Berichte FZKA 6087 Transkriptionelle Repression als molekulare Grundlage der anti-inflammatorischen Wirkung von Glucocorticoiden Stefanie Heck Institut für Genetik von der Fakultät für Bio- und Geowissenschaften der Universität Karlsruhe (TH) genehmigte Dissertation Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, Karlsruhe 1998

2 Inhalt 1 Einleitung Biologische Wirkungen von Glucocorticoiden Struktur des Glucocorticoidrezeptors (GR) Mechanismus der Steroidhormonwirkung am Beispiel des GR: Regulation der Genexpression Positive Genregulation: Transaktivierung durch den GR Negative Genregulation: Transrepression durch den GR Kompetition um eine überlappende Bindestelle: Das Rinder Prolaktin-Modell Ausbildung eines inaktiven Komplexes: Interaktion zwischen GR und AP-1 am Beispiel des menschlichen Kollagenase I-Gens Ausbildung eines inaktiven Komplexes: Interaktion zwischen GRundNF-KB Fragestellung 13 2 Material und Methoden 15 Material 2.1 Bezugsquellen der Chemikalien und Verbrauchsmaterialien Oligonukleotide Plasmidkonstrukte Sonden für RNA-Hybridisierungen Antikörper Bakterien und eukaryontische Zellen 21 Methoden 2.7 Allgemeine Methoden zur Behandlung von Nukleinsäuren 24 Extraktion von Nukleinsäuren 24 Ausfällung von Nukleinsäuren aus wäßrigen Lösungen 24 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren DNA-Klonierungstechniken 24 Fragmentierung von DNA mit Restriktionsenzymen 24 Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Agarose-Gelelektrophorese 25 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 25 Ligation von DNA-Fragmenten in Vektoren 25 Erststrang-cDNA-Synthese durch Reverse Transkription 25 Amplifikation von cdna mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 26 Präparation von kompetenten Bakterien für die Transformation (nach Hanahan, 1986) 26 Transformation von Bakterien (nach Hanahan, 1986) 26

3 u 2.9 Präparation von rekombinanter Plasmid-DNA aus transformierten Bakterien 26 Plasmid-DNA-Präparation in kleinem Maßstab ("Minipräp") 26 Plasmid-DNA-Präparation in großem Maßstab ("Maxipräp") Sequenzierung von DNA und Auftrennung der Reaktionsprodukte 27 Sequenzierung von DNA (nach Sanger et al., 1977) 27 Auftrennung der Sequenzierreaktionen durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese Radioaktive Markierung und Reinigung von Sonden für RNA-Hybridisierungen Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten 28 Reinigung von radioaktiv markierten DNA-Fragmenten durch Gelfiltration Allgemeine Methoden zur Behandlung von Proteinen 29 Proteinbestimmung (Lowry et al., 1951) 29 Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen über SDS-Polyacrylamidgele (Laemmli, 1970) 29 Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen Zellkultur 30 Passagieren von Zellen 30 Einfrieren und Auftauen von Zellen 31 Herstellung von CCS (charcoal calfserum) für transiente Transfektionen (nach Westley und Rochefort, 1980) Transiente Transfektionen 31 Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode (nach Graham und van der Eb, 1973) 31 DEAE-Dextran-Methode (nach Kawai und Nishizawa, 1984) Analyse der Genexpression durch den Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Aktivitätstest (Gorman et al., 1982) 32 Präparation von Proteinextrakten für CAT-Analysen 32 CAT-Aktivitätstest Analyse der Genexpression durch den Luciferase-Aktivitätstest (nachdewetetal.,1987) 33 Präparation von Proteinextrakten für Luciferase-Analysen 33 Luciferase-Aktivitätstest Analyse von RNA durch Transfer auf Membranen und Detektion durch radioaktiv markierte DNA-Fragmente (Northern-Blof) 34 Präparation von poly A + RNA aus Zellen 34 k Auftrennung von RNA durch Agarose-Gelelektrophorese 34 Northern-Blot und Hybridisierung Analyse von Proteinen durch Transfer auf Membranen und Detektion durch spezifische Antikörper (Western-Blot) 36 Präparation und Auftrennung von Proteinextrakten für den Western-Blot 36 Western-Blot und Detektion von Proteinen auf Membranen 36

4 2.19 Analyse von Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe von GST-Fusionsproteinen In vitro Transkription/Translation 37 Produktion und Reinigung von Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionsproteinen 37 GST-Fusionsprotein-Interaktionstest 38 3 Ergebnisse Trennung von Transaktivierung und Transrepression mit Hilfe von Mutanten des GR und Vergleich seiner transreprimierenden Aktivität an verschiedenen Zielgenen Zur Unterscheidung von Transaktivierung und Transrepression verwendete Mutanten Transaktivierende Eigenschaften der Gruppe I- und Gruppe Ü-Mutanten Mutationen in der Dimerisierungsdomäne beeinträchtigen nicht die Fähigkeit des GR, die Aktivität des Transkriptionsfaktors AP-1 zu reprimieren Dissoziierende Mutanten des GR unterscheiden zwischen verschiedenen Mechanismen der Transrepression Trennung der positiven und negativen Genregulation durch den GR mit Hilfe von Liganden und Zuordnung einer dieser Eigenschaften zu deren anti-inflammatorischer Wirkung Glucocorticoid-Antagonisten eignen sich nur begrenzt zur Dissoziation von Transaktivierung und Transrepression Bestimmte Glucocorticoid-Analoga können zwischen Transaktivierung und Transrepression unterscheiden Hemmung der Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-KB durch den GR Synthese des Inhibitorproteins IKBOC durch den GR Die Transkription des ikba-gens wird durch Dexamethason induziert Eine Mutante des GR reprimiert die NF-KB-Aktivität, obwohl sie IKBOC nicht mehr synthetisieren kann Dissoziierende Steroid-Analoga können die NF-KB-Aktivität nicht mehr reprimieren, obwohl sie die ikba-synthese noch vermitteln Andere Steroidhormonrezeptoren hemmen die Aktivität von NF-KB, ohne IKBOC ZU induzieren Protein-Protein-Interaktion zwischen NF-KB und dem GR Bereiche in der DNA-Bindedomäne und im Carboxy-Terminus des GR sind an der Hemmung der NF-KB-Aktivität beteiligt Die beiden NF-Kß-Untereinheiten p65 und p50 interagieren mit einem Bereich im Carboxy-Terminus des GR 79 in

5 4 Diskussion Trennung von positiver und negativer Genregulation Unterscheidung durch Mutanten des GR Unterscheidung durch Liganden des GR Unterscheidung verschiedener Mechanismen der negativen Genregulation Transkriptionelle Interferenz zwischen dem GR und NF-KB Glucocorticoid-induzierte Synthese des Inhibitorproteins IKBOC Interaktion zwischen dem GR und NF-KB Physiologische Bedeutung der negativen Genregulation 94 5 Abkürzungen 97 6 Literatur 99 IV