Ernährung, Kultivierung &! Metabolismus von! Mikroorganismen!

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1 Ernährung, Kultivierung & Metabolismus von Mikroorganismen

2 Mikrobielles Periodensystem

3 Mikrobielle Ernährung: Makronährstoffe in Kulturmedien Makronährstoffe: benötigt in grossen Mengen Mikronährstoffe: geringe Mengen, oft nur Spuren

4 Mikrobielle Ernährung C: aus organischen Verbindungen oder CO2 50% Trockengewicht der Zelle = C N: aus organischen oder anorganischen Verbindungen 12% Trockengewicht der Bakterienzelle = N P: aus organischen & anorganischen Phosphaten für Nukleinsäuren & Phospholipide S: hauptsächlich aus Sulfat & Sulfid für met, cys, Vitamine K: Cofaktor für Enzyme Mg: Stabilisierung von Ribosomen, Membranen, DNA/RNA Ca: Stabilisierung von Zellwänden, Endosporenbildung

5 Mikrobielle Ernährung Fe: wichtig in Cytochromen & FeS-Proteinen (Elektronen- transport in der Atmung) Aufnahme in die Zelle durch Siderophore wichtiger Pathogenitätsfaktor, in vielen Geweben Fe-Mangel Mikronährstoffe = Spurenelemente: Metalle, häufig Cofaktoren für Enzyme Zugabe zu Labormedien häufig unnötig, weil ausreichend in komplexen Medien vorhanden Wachstumsfaktoren: Vitamine, z. T. auch aa, Purine, Pyrimidine Bedarf variiert mit Organismus

6 Mikrobielle Ernährung Klassen von Medien, aseptische Technik: im Praktikum

7 Metabolismus: Katalyse & Enzyme alle Organismen konservieren Energie - wie? Energie = Fähigkeit zu arbeiten, in [kj] freie Energie G steht für Arbeit zur Verfügung ΔG 0 = Veränderung der freien Energie während einer Reaktion = Veränderung 0 = freie Energie wurde gemessen bei ph 7, 25 C, 1 Atmosphäre Druck, alle Ausgangssubstanzen 1M (Standardbedingungen) A + B C + D wenn ΔG 0 = negativ, d.h. Reaktion läuft unter Freisetzung von freier Energie ab = exergon kann als ATP gespeichert werden

8 Metabolismus: Katalyse & Enzyme A + B C + D wenn ΔG 0 = negativ, d.h. Reaktion läuft unter Freisetzung von freier Energie ab = exergon kann als ATP gespeichert werden = positiv, d.h. Reaktion läuft unter Verbrauch von Energie ab = endergon Berechnung von ΔG 0 aus freier Energie der Ausgangssubstanzen und Produkte G 0 f = freie Energie der Bildung einer Verbindung Wert der G 0 f von Elementen in elementarer Form = 0 für die meisten Verbindungen ist G 0 f negativ

9 TABLE 5 Free energy of formation for a few compounds of biological interest Compound Free energy of formation a Water (H 2 O) Carbon dioxide (CO 2 ) Hydrogen gas (H 2 ) 0 Oxygen gas (O 2 ) 0 Ammonium (NH + 4 ) Nitrous oxide (N 2 O) Acetate (C 2 H 3 O - 2 ) Glucose (C 6 H 12 O 6 ) Methane (CH 4 ) Methanol (CH 3 OH) a The free-energy values (G f 0 ) are in kj/mol. By convention the G f 0 for the elements (C, H 2, O 2, N 2 ) is zero

10 Rechenbeispiele Calculation of the change in standard free Energy ΔG 0 from G f 0 (1) A + B C 6 H 12 O O 2 C + D 6 CO H 2 O ΔG 0 = ΔG 0 f [C + D] - ΔG0 f [A + B] [6x x ] - [ ] ΔG 0 = kj (ph 7.0; 25 C; 1M) (2) C 6 H 12 O 6 [A] 2 C 3 H 6 O 3 [B] ΔG 0 = ΔG 0 f [B] - ΔG0 f [A] [2x 517.8] - [ ] ΔG 0 = kj (ph 7.0; 25 C; 1M)

11 Funktion von Enzymen beschleunigen der Reaktion durch Reduktion der Aktivierungsenergie = Katalyse Katalysator bleibt unverändert Energetik & Gleichgewicht bleiben unverändert

12 Funktion von Enzymen

13 Funktion von Enzymen beschleunigen der Reaktion durch Reduktion der Aktivierungsenergie = Katalyse Katalysator bleibt unverändert Energetik & Gleichgewicht bleiben unverändert biologische Katalysatoren = Enzyme (Proteine, RNAs) hohe Spezifizität, abhängig von Enzymstruktur Bildung von Enzym-Substrat-Komplexen (Wasserstoffbrücken, van der Waals, hydrophobe Wechselwirkungen) über aktives Zentrum

14 Enzyme beschleunigen Reaktionen bis fach wichtig: substratspezifische Bindung Interaktion des Substrats mit katalytisch aktiven aa im aktiven Zentrum führt zur Schwächung spezifischer Bindungen im Substrat reduziert Aktivierungsenergie für Produktbildung

15 Bsp: Fructosebisphosphataldolase

16 Enzyme beschleunigen Reaktionen bis fach wichtig: substratspezifische Bindung Interaktion des Substrats mit katalytisch aktiven aa im aktiven Zentrum führt zur Schwächung spezifischer Bindungen im Substrat reduziert Aktivierungsenergie für Produktbildung Enzyme können sowohl exergone als auch endergone Reaktionen beschleunigen, letztere unter Zuführung von Energie (ATP)

17 Redox-Reaktionen & energiereiche Verbindungen Oxidation = Entfernen von Elektronen vom e - -Donor Redox reactions Reduktion = Hinzufügen von Elektronen zum e - -Akzeptor A red A ox + n electrons B ox + n electrons B red H 2 " 2 H + + 2e- 1/2 O e- " O 2-2H + + O 2- " H 2 O H 2 + 1/2 O 2 " H 2 O

18 Redox-Potential Substanzen unterscheiden sich in ihrer Neigung, oxidiert oder reduziert zu werden = Redoxpotential, gemessen in Volt, in Bezug auf H 2, bei ph 7 E 0 je nach Reaktionspartner können viele Moleküle sowohl Elektronen-Donor als auch -Akzeptor sein bei Redox-Paaren steht die oxidierte Form links: NAD + /NADH bei Redox-Reaktionen gibt die reduzierte Form des Redox- Paares, dessen E 0 negativer ist, Elektronen ab an die oxidierte Form des Paares, dessen E 0 positiver ist

19 natürliche Spannbreite

20 E 0 proportional zu ΔG 0 Redox-Potential bei Redoxreaktionen freigesetze Energie kann z.b. als ATP gespeichert werden d.h. Elektronendonoren sind Energiequellen in Gegenwart geeigneter -Akzeptoren

21 NAD als e - Überträger bei Redoxreaktionen Elektronenüberträger: 1) Frei diffundierbar (Coenzyme): NAD +, NADP + 2) fest an Enzyme gebunden (prosthetische Gruppen); bei membran-gekoppelten e - Transferreaktionen NAD +, NADP + übertragen gleichzeitig 2 e - und 2 H + E 0 für NAD + /NADH (oder NADP + /NADPH) = -0,32V d.h. NAD(P)H ist guter e - Donor NAD + /NADH in energieerzeugenden Reaktionen NADP + /NADPH in biosynthetischen Reaktionen

22 Nicotinamid- adenindinucleotid (NAD + ) P i

23 Redoxreaktionen mit NAD +

24 Model of the 1,5-anhydro-D-fructose reductase structure Dambe et al. (2006) Biochemistry 45:10030

25 His-76 Lys-94 His-180 Asp-176 Ser-33

26 Energiereiche Verbindungen & Energiespeicherung freie Energie der Hydrolyse

27 Energiereiche Verbindungen & Energiespeicherung Energiespeicherung in lebenden Organismen: chemische Energie aus Redoxreaktionen v.a. als Phosphat nicht alle Phosphatbindungen sind energiereich Zellen benutzen i.a. Verbindungen mit ΔG 0 > 30 kj/mol als Energiespeicher

28 Energiereiche Verbindungen & Energiespeicherung freie Energie der Hydrolyse

29 Energiereiche Verbindungen: ATP wichtigste Energieeinheit in Zellen in aktiv wachsenden Zellen: ATP/ADP = 1000, d.h. Energiebedarf für ATP Synthese ist > als Energie, die freigesetzt wird bei der ATP Hydrolyse

30 Energiereiche Verbindungen & Energiespeicherung freie Energie der Hydrolyse

31 Energiereiche Verbindungen: Coenzym A energiereiche Thioesterbindung besonders wichtig bei anaeroben Mikroorganismen, deren Metabolismus über Fermentation läuft

32 Langfristige Energiespeicherung ATP in relativ geringer Konzentration in der Zelle (2mM) für langfristige Energiespeicherung in Prokaryoten unlösliche Polymere, die zur Bildung von ATP oxidiert werden können, z.b. Glycogen, Poly-ß-Hydroxybutyrat, Polyhydroxyalkanoat in der Zelle als Granula gelagert in Eukaryoten: Polyglucose = Stärke, Fette

33 Katabolismus & Elektronentransport in Mikroorganismen Chemorganotrophe: Fermentation & Atmung bei beiden: Synthese von ATP durch Energie aus Redox-Reaktionen Fermentation: ohne exogene Elektronenakzeptoren Substratkettenphosphorylierung Atmung: mit exogenem Elektronenakzeptor (O 2 ) oxidative Phosphorylierung, ATP durch PMF bei Phototrophen: Photophosphorylierung zur ATP-Bildung hier erzeugt Licht Energie für Redox-Reaktionen zur PMF-Bildung

34 Katabolismus & Elektronentransport in Mikroorganismen

35 x 2 H + Glycolyse als Bsp. für Fermentation

36 Glycolyse als Bsp für Fermentation Emden-Meyerhof-Weg = Fermentation von Glucose 3 Hauptstufen: 1) Vorbereitungsreaktionen, keine Energiefreisetzung 1 Glucose 2 Glycerinaldehyd-3-P 2) Redox-Reaktionen, Bildung von ATP & Pyruvat 3) Redox-Reaktionen, Bildung von Fermentationsprodukten

37 x 2 H + Glycolyse als Bsp. für Fermentation

38 Atmung & membrangebundene Elektronenüberträger Fermentation: keine externen e - -Akzeptoren geringe Energiegewinnung keine komplette Oxidation der C-Atome in Glc zu CO2 Atmung: vollständige Oxidierung von Glucose zu CO2 hohe ATP-Ausbeute O2 als terminaler e - -Akzeptor: aerobe Atmung Transfer von Elektronen Umwandlung von organischem C zu CO2 dabei Bildung von ATP über PMF

39 Elektronentransportsysteme in der Atmung membrangebunden vermitteln e- Transport vom Donor zum Akzeptor speichern einen Teil der freigesetzten Energie der Redox- Reaktion zur ATP-Synthese

40 Elektronentransportsysteme in der Atmung NADH-Dehydrogenasen: an der Innenseite der Cytoplasmamembran binden NADH im aktiven Zentrum, nehmen 2e- und 2H+ auf bei der Umwandlung zu NAD+, und geben diese an Flavoproteine: proteingebundenes Flavin, das reduziert oder oxidiert wird nehmen 2e- und 2H+ auf, aber geben nur e- ab häufig Flavinmononucleotid (FMN) und Flavinadenindinucleotid (FAD) Flavinquelle ist Riboflavin (= Vitamin B2), Wachstumsfaktor

41 Flavinmononucleotid (FMN) Redox cofactor

42 Elektronentransportsysteme in der Atmung Cytochrome: enthalten Häm als prosthetische Gruppe übertragen nur e- Redoxstelle ist Fe (2+ oder 3+) mehrere Klassen: a, b, c je nach Hämtyp können mit Eisen-Schwefel-Proteinen Komplexe bilden diese übertragen auch nur e-

43 Nicht-Häm Eisen-Schwefelproteine Redox Cofaktor Fe 2 S 2 -Zentrum Fe 4 S 4 -Zentrum

44 Elektronentransportsysteme in der Atmung Chinone: Coenzym Q stark hydrophob kein Proteinanteil Vitamin K verwandt nehmen 2H+ und 2e- auf geben nur e- weiter

45 Redoxpotential von Redox-Systemen typisch für Mitochondrien und manche Bakterien wie P. denitrificans E. coli fehlen Cytochrome c und aa 3 ; die Elektronen gehen direkt von Cyt b zu Cyt o oder d. währen des e- Transports wird ATP durch oxidative Phosphorylierung gebildet

46 Die protonenmotorische Kraft (PMF) während des e- Transports werden e- und H+ getrennt und H+ aus der Zelle ausgeschieden: Anreicherung von H+ aussen bei der Atmung: am Ende Transfer der Elektronen zu O2 und dessen Reduktion zu H2O; dafür wird H+ aus H2O-Spaltung im Cytosol verbraucht: Anreicherung von OH- innen weil geladen können H+ und OH- nicht durch die Membran diffundieren

47 Die protonenmotorische Kraft (PMF) d.h. Bildung eines ph-gradienten und elektrochemischen Potenzials über der Membran = PMF Membran der Zelle ist wie eine Batterie aufgeladen diese elektrische Energie kann in ATP umgewandelt werden (1961 Peter Mitchell, chemiosmotic theory ) oder zum Ionentransport oder zur Flagellenbewegung benutzt werden

48 Die protonenmotorische Kraft (PMF) wesentlich in allen e- Transportketten: 1) Reihe membrangebundener e- Überträger, die nach aufstei- genden E 0 -Werten angeordnet sind 2) Abwechseln in der Kette von e- und e-/h+ Überträgern 3) Erzeugung der PMF durch Trennung der Ladungen über der Membran, innen -, aussen +

49 PMF & die Bildung von ATP: ATP-Synthase Nobelpreis Chemie, 1997 John Walker & Paul Boyer

50 PMF & die Bildung von ATP F 1 Kopf im Cytoplasma F 0 in der Membran = Protonenkanal katalysieren zusammen die Bildung (oder Spaltung) von ATP hoch konserviert kleinster bekannter biologischer Motor: H+ Transport durch a-untereinheit treibt Rotation der C-Proteine Drehmoment wird auf F1 übertragen, führt zur Konformations- änderung der ß-Untereinheiten, genutzt zur ATP-Bildung = oxidative Phosphorylierung bei Atmung Photophosphorylierung bei phototrophen

51 ATP-Synthase ist umkehrbar: ATP-Spaltung führt zu H+ Transport nach aussen, d.h. Erzeugung von PMF Inhibitoren hemmen e- Fluss, z.b. CO, CN - (beide binden Cytochrom a) Entkoppler verhindern ATP-Synthese, nicht Elektronentransport z.b. Dinitrophenol, Dicumarol: machen Membranen H+ durchlässig, zerstören PMF

52 Kohlenstofffluss bei der Atmung Citrat-Zyklus: von Glucose bis Pyruvat wie bei Glycolyse; dann: vollständiger Abbau des Pyruvat zu CO2 dabei e- Übertragung auf NAD+ und FAD, von dort auf O2 oder andere terminale Akzeptoren dadurch wesentlich höhere Energieausbeute als bei der Fermentation

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54 Kohlenstofffluss bei der Atmung Citrat-Zyklus liefert ausserdem Ausgangsprodukte für Biosynthese: aa Synthese Cytochrome, Chlorophyll Fettsäuren

55 Alternativen des Katabolismus: anaerobe Atmung andere e- Akzeptoren als O2 weniger Energiefreisetzung als mit O2 dafür Möglichkeit, in O2-freien Habitaten zu leben

56 Alternativen des Katabolismus: Chemolithotrophie Energie/e- aus anorganischen Verbindungen; z.b. H2S, H2, Fe2+, NH3 meist aerob e- Transportkomplexe & PMF C für Biosynthese aus CO2 (autotroph)

57 Alternativen des Katabolismus: Phototrophie

58 Alternativen des Katabolismus: Bedeutung der PMF