Human Insulin in der Ph.Eur.
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- Hartmut Brauer
- vor 8 Jahren
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1 Human Insulin in der Ph.Eur. Das europäische Arzneibuch enthält insgesamt 11 Monographien zum Thema Insuline: Lösliches Insulin als Injektionslösung (6.0/0834) Insulin human (6.0/0838) Insulin vom Rind (6.0/1637) Insulin vom Schwein (6.0/1638) Insulin aspart (6.0/2084) Insulin lispro (6.0/2085) Biphasische Insulin-Suspension zur Injektion (6.0/0831) Insulin-Zink-Kristallsuspension zur Injektion (6.0/0836) Insulin-Zink-Suspension zur Injektion (6.0/0837) Amorphe Insulin-Zink-Suspension zur Injektion (6.0/0835) Insulinzubereitungen zur Injektion (6.0/0854).
2 Human Insulin in der Ph.Eur. Nach der Arzneibuchdefinition ist Humaninsulin ein 2-kettiges Peptid, das die Struktur des vom Pankreas des Menschen gebildeten antidiabetischen Hormons besitzt. Der Gehalt an Humaninsulin C257H383N65O77S6 muss zusammen mit A21-Desamino-Insulin zwischen 95,0 % und 105,0 % liegen. Für die Beschriftung von Insulinzubereitungen gilt vereinbarungsgemäß, dass 0,0347 mg Humaninsulin 1 I.E. Insulin entsprechen. Mit dieser Vereinbarung verzichtet das Arzneibuch auf eine Aktivitätsprüfung, auch weil die Herstellungs- und Charakterisierungsverfahren heute so ausgefeilt sind, dass man glaubt, von den Mengen an Insulin auch auf die Wirksamkeit, d.h. auf die tatsächlich aktive Fraktion, des Insulins schließen zu können.
3 Humanisierung von Schweine-Insulin Da es sich bei den tierischen Insulinen zwar um wirksame aber dennoch um Fremdproteine handelt, die somit ein nicht unerhebliches immunogenes Potential besitzen, wurde verstärkt daran gearbeitet, authentisches, humanes Insulin bereitzustellen. Vollsynthetisch lässt sich Insulin nicht ökonomisch herstellen. Ein zwischenzeitlich quasi historisches, aber dennoch sehr wichtiges Verfahren, ist die Herstellung von Human-Insulin aus Schweine-Insulin. Dieses Verfahren hat maßgeblich dazu beigetragen, moderne Insuline gentechnisch herzustellen, weshalb es an dieser Stelle Erwähnung finden soll.
4 Humanisierung von Schweine-Insulin Für die Herstellung von Humaninsulin werden zwei Alternativen erwähnt: Die enzymatische Umwandlung von Insulin aus Schweinepankreas, wobei hier darauf hingewiesen wird, dass durch Validierung sicherzustellen ist, dass restliche proteolytische Aktivitäten vollständig entfernt wurden. Die gentechnische Herstellung von Humaninsulin. In diesem Fall muss vor der Freigabe jede Charge des fertigen Produktes als Bulk die Einhaltung der Grenzwerte von Wirtszellproteinen und einkettigen Präkursor-Molekülen geprüft werden
5 Humanisierung von Schweine-Insulin
6 Beispiele für Protein Spaltungsreagenzien Spaltungsagenz Enzyma:sche Spaltung Trypsin Chymotrypsin Pepsin Endoproteinase Lys C V8 Protease aus Staphylococcus aureus Endoproteinase Asp N Endoproteinase Arg C (Clostripain) Chemische Spaltung Cyanbromid 2 Nitro 5 thio cyanobenzoesäure Spaltungsspezifität C terminal nach Arginin und Lysin C terminal nach hydrophoben Aminosäuren (z.b. Leucin, Methionin, Alanin, aroma@sche Aminosäuren) unspezifisch C terminal nach Lysin C terminal nach Glutaminsäure und Asparaginsäure N terminal vor Asparaginsäure C terminal nach Arginin C terminal nach Methionin N terminal vor Cystein
7 Humanisierung von Schweineinsulin
8 3. An:diabe:ka (Humaninsuline) Humaninsulin Insulin B. Braun Basal/B. Braun humanisiertes Schweine Insulin
9 Gentechnische Alternative Derzeit sind drei Verfahren etabliert, nach denen rekombinantes Human-Insulin hergestellt wird oder hergestellt wurde. Um Human-Insulin in Bakterien herstellen zu können, boten sich zwei Alternativ- Strategien an: Entweder verwendet man zwei Teilgene, die jeweils für die A- und für die B-Kette codieren. Dieses Verfahren ist zwischenzeitlich obsolet. Oder man verwendet das natürliche Gen als Informationsspeicher. In diesem Fall erhält man allerdings das Vorläuferprotein, das dann in nachgeschalteten biochemischen/biotechnischen Verfahren zum funktionellen Protein konvertiert werden muss. Beim dritten Verfahren wird ein so genanntes Mini-Proinsulin in S. cerevisiae hergestellt.
10 1. Expression von zwei Teilgenen in zwei E. coli-stämmen Dieses Verfahren hat nur noch historische Bedeutung!
11 Sulfitolyse
12 2. Expression von Proinsulin in E. coli Bei diesem Verfahren wird nur ein einziges Plasmid und nur ein transgener E.-coli-Stamm für die Produktion verwendet. Das Plasmid trägt das komplette Insulin-Gen, also die genetische Information für die Insulin-A-, B- und C-Kette. Das Gen wird exakt hinter einem Methionin-Codon des Tryptophan-Synthase-Gens inseriert, so dass wiederum ein Fusionsprotein synthetisiert wird. Das Proinsulin wird aus dem Fusionsprotein durch CNBr-Behandlung freigesetzt und durch oxidative Sulfitolyse in das Sulfonatderivat überführt. Durch Behandlung von Proinsulin mit Carboxypeptidase B und Trypsin wird das C-Peptid entfernt, und man erhält aktives Insulin in guter Ausbeute.
13 3. An:diabe:ka (Humaninsuline) Humaninsulin Insuman Rapid/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Insuman Basal/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Insuman Comb 15/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Insuman Comb 25/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Insuman Comb 50/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Insuman Infusat/Sanofi Aven:s Pharma E. coli Humaninsulin Berlinsulin H Basal/Berlin Chemie E. coli Humaninsulin Huminsulin Basal /Lilly E. coli Humaninsulin Huminsulin Normal /Lilly E. coli Humaninsulin Huminsulin Profil /Lilly E. coli
14 3. Expression von Mini-Proinsulin Statt das Protein von Bakterien synthetisieren zu lassen, wird hierbei die Bäckerhefe S. cerevisiae als Wirts-System verwendet. Ferner sollte das rekombinante Protein von dem Hefe-Produktionsstamm sezerniert werden, um das Rohprodukt bereits soweit wie möglich frei von Wirts-Proteinen isolieren zu können. Das Protein stammt von einem Kunst-Gen darin, das nur einen sehr kurzen C-Peptid-Anteil (9 Nukleotide) enthält. Die rekombinanten Hefezellen sezernieren eine Proinsulin-Variante, die einen korrekten N-Terminus besitzen und in denen alle Disulfidbrücken korrekt geknüpft sind. Zur Entfernung des Mini-C-Peptids wird die gleiche Technologie angewendet, wie sie bereits für die Umwandlung von Schweine-Insulin in Human-Insulin etabliert ist.
15 3. An:diabe:ka (Humaninsuline) Humaninsulin Actrapid /Novo Nordisk S. cerevisiae Humaninsulin Actraphane /Novo Nordisc S. cerevisiae Humaninsulin Insulatard /Novo Nordisc S. cerevisiae Humaninsulin Velosulin /Novo Nordisc S. cerevisiae Humaninsulin Insuman Comb 50/Sanofi Aven:s Pharma S. cerevisiae Humaninsulin Protaphane /Novo Nordisc S. cerevisiae Humaninsulin Mixtard /Novo Nordisk S. cerevisiae
16 Exubera, ein inhalativ zu applizierendes Normal-Insulin Inhalatives Humaninsulin ist ein schnell wirkendes Humaninsulin zur Behandlung von Typ-1- und Typ-2-Diabetes. Es kann zur Verbesserung der glykämischen Kontrolle allein oder in Kombination mit anderen oralen Antidiabetika und/oder lang wirkenden oder verzögert wirkenden, subkutan injizierbaren Insulinen verwendet werden. Obwohl das in Exubera enthaltene Insulin nicht zu den modifizierten Insulinen zählt, besitzt es einen schnelleren Wirkungseintritt als subkutan injiziertes, schnell wirkendes Humaninsulin. Daher sollte es innerhalb von 10 Minuten vor Beginn einer Mahlzeit gegeben werden. Während einer Therapie mit Exubera dürfen die Patienten nicht rauchen. Das Rauchen muss mindestens 6 Monate vor Beginn der Behandlung mit Exubera aufgegeben worden sein. Auch bei Patienten mit bestehenden Lungenerkrankungen, wie z.b. Asthma oder COPD, sollte Exubera nicht angewendet werden, da nur begrenzte Daten über die Sicherheit der Anwendung bei diesen Patienten vorliegen. Im Herbst 2007 stellte Pfizer die Produktion von Exubera in Frankfurt ein die Patienten hatten das Medikament nicht ausreichend nachgefragt. Nach 11 Jahren Entwicklung war Exubera knapp ein Jahr auf dem Markt.
17 3. An:diabe:ka (Humaninsuline) Humaninsulin Exubera /Pizer E. coli A. Mittlere Glukoseinfusionsrate (GIR) im Verhältnis zur maximalen GIR verschiedener Therapieregime bei Probanden bezogen auf die Zeit. B. Durchschnittliche Veränderung der freien Insulinkonzentrationen im Serum (µe/ml) nach Inhalation von 4 mg Humaninsulin bzw. einer subkutanen Injektion von 12 Einheiten schnell wirkendem Humaninsulin bei adipösen Personen mit Typ-2-Diabetes.
Humanisierung von Schweine-Insulin
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