Tierärztliche Hochschule Hannover

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Der Einfluss des Kollagen-bindenden Integrins α2/β1 auf die Entstehung von heterotopen Ossifikationen in der murinen Sehne INAUGURAL-DISSERATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Gertje Neu Weener Hannover 2021

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr Klinik für Heimtiere, Reptilien u. Vögel, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. med. Richard Stange IMM Münster 1.Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr 2.Gutachter: PD Dr. habil. Astrid Bienert-Zeit Tag der mündlichen Prüfung: 9. November 2021

3 In Liebe und Dankbarkeit meinen Eltern gewidmet.

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5 INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... I ABBILDUNGSVERZEICHNIS...III TABELLENVERZEICHNIS... IV 1 EINLEITUNG LITERATURÜBERSICHT Architektur des Sehnengewebes Entstehung von Heterotopen Ossifikationen in der Sehne Einflussfaktoren für die chondrogene Differenzierung von Vorläuferzellen Frühe Chondrogenese und Kollagen II Produktion Hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und Kollagen X Synthese Tiermodelle zur Untersuchung von HO an Sehnen Tiermodelle mit traumatisch/entzündlichen Ursachen für HO Tiermodelle mit transgenen Mäusen Die Transmembranmoleküle Integrine Das Integrin α2/β Die Integrin α2/β1 knockout Maus Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit MATERIAL UND METHODEN Material Versuchstiere Geräte Chemikalien, Lösungsmittel und Medikamente Puffer und Lösungen Färbemittel, Proteasen und industrielle Kits Antikörper Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Computersoftware Versuchstiere Gruppeneinteilung Operativer Eingriff an Versuchstieren Vorbereitung und Anästhesie Operatives Vorgehen Postoperative Nachsorge Tötung und Entnahme von Gewebeproben µ-ct Untersuchungen Untersuchungsablauf Quantitative Auswertung der Ossifikationen Histologische und immunhistochemische Färbungen... 33

6 3.6.1 Vorbereitung der Proben für die Histologie Herstellung von Paraffinschnitten Histochemische Färbungen Immunhistochemische Färbungen Quantitative Auswertung Statistische Auswertung ERGEBNISSE Evaluation der Operationsmethode Klinische Untersuchung und Kontrolle der operierten Tiere Operationsdauer Postoperative Messung des Sprunggelenkwinkels Histologische Untersuchung des Heilungsverlaufes Untersuchung der heterotopen Ossifikationen an nativen Sehnen Untersuchung von WT und ITGA2-/- hinsichtlich Körpergewichts und Tibialänge Morphometrische Analyse der HO an nativen Sehnen Untersuchung der HO an operierten Sehnen Morphometrische Analyse der HO an operierten Sehnen Auswertung der immunhistochemischen Untersuchung DISKUSSION Entwicklung eines kliniknahen Operationsmodells Entstehung von HO an nativen Sehnen Entstehung von HO an operierten Sehnen ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS DANKSAGUNG VERSICHERUNG AN EIDES STATT...99

7 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis C Grad Celsius µ-ct Mikro-Computertomograph Abb. Abbildung ADAMTS A disintegrin and metalloproteinase Ag Antigen Ak Antikörper Aqua dest. Aqua destillata Bgn Biglykan BMP Bone morphogenic protein ca. circa Ca 2+ Kalzium-Ionen (2-wertig positiv) Cbfa1 Core binding factor α1 Col2a Kollagen IIa COMP Cartilage oligomeric matrix Protein COX-2 Cyclooxygenase-2 DDR2 discoidin domain receptor-2 ECM Extrazelluläre Matrix ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay Fmod Fibromodulin FOP Fibrodysplasia ossificans progressiva GDF Growth and differentiation factor GFOGER-Sequenz Glycin-Phenylalanin-Hydroxyprolin- Glycin-Glutaminsäure-Arginin- Sequenz GFP Green fluorescent protein h hours (Stunden) HCl Hydrogenchlorid HIF-1α Hypoxia induced transcription factor HO Heterotope Ossifikationen Ig Immunglobulin Ig-CAM Immunglobulin-Zelladhäsionsmoleküle IGF Insulin-like growth factor IL Interleukin ILK Integrin linked kinase ITGA2 Integrin α2/β1 KGW Körpergewicht L Liter Mg 2+ MIDAS Region Magnesium-Ionen (2-wertig positiv) Metall Ion Depend Adhesion Site I

8 Abkürzungsverzeichnis min Minuten ml Milliliter Mm Millimeter MMP Matrix-Metalloproteasen Mn 2+ Mangan-Ionen (2-wertig positiv) Msx2 Msh homeobox2 NaOH Natriumhydroxid Neg. Negativ NSAID nichtsteroidales Antiphlogistikum Nse Neuronenspezifische Enolase o.g. oben genannt p Signifikanzwert PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion PDGF Platelet-derived growth factor PGE Prostaglandin pos. Positv ROI Region of interest RT Raumtemperatur Runx2 Runt-related transcription factor 2 sec. Sekunden sirna small interfering ribonucleic acid Sox 9 protein SRY (sex determining region Y)- box 9 Tab. Tabelle TBS TRIS- gepufferte Kochsalzlösung TDPCs Tendon derived progenitor cells TGF-β Transforming growth factor-beta TNF Tumor-Nekrosis-Factor TRIS Trishydroxymethylaminomethan VEGF Vascular Endothelial Growth Factor WT Wildtyp II

9 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Differenzierungswege der TDPCs Abb. 2: Stadien der Chondrogenese und ihre spezifischen Marker... 9 Abb. 3: Familie und Struktur der Integrine Abb. 4: Aufbau für den Tierversuch Abb. 5: Schematische Darstellung der 2-fachen Kernnaht modif. nach Lange Abb. 6: Übersicht der Operationschritte Abb. 7: Auswertung des Knochenvolumens Abb. 8: Auswertung der histologischen Präparate Abb. 9: Operationsdauer Abb. 10: Darstellung des Sprunggelenkwinkels zu verschiedenen Zeitpunkten Abb. 11: Darstellung des Heilungsverlaufes auf histologischer Ebene Abb. 12: Darstellung der Kollagenproduktion im Heilungsverlauf Abb. 13: Vergleich von Körpergewicht in (A) und Tibialänge (B) Abb. 14: Vergleich der HO an nativen Sehnen Abb. 15: Vergleich von HO an operierten Sehnen Abb. 16: Knochenvolumen der HO an operierten Sehnen im Zeitverlauf Abb. 17: Kollagen II Anteil 2 Wochen post OP Abb. 18: Kollagen II Anteil 4 Wochen post OP Abb. 19: Kollagen X Anteil 4 (A,B) und 6 (C,D) Wochen post OP III

10 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tab. 1: Auflistung der Versuchstiere Tab. 2: Auflistung verwendeter Laborgeräte Tab. 3: Auflistung verwendeter Chemikalien, Lösungsmittel und Medikamente Tab. 4: Auflistung und Zusammensetzung verwendeter Puffer und Lösungen Tab. 5: Auflistung verwendeter Färbemittel und industrieller Kits Tab. 6: Auflistung verwendeter Antikörper Tab. 7: Auflistung der verwendeten Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialen Tab. 8: Auflistung verwendeter Computersoftware Tab. 9: Gruppeneinteilung für den operativen Tierversuch IV

11 Einleitung 1 Einleitung Die Behandlungen von Verletzungen des Bewegungsapparates, wie der Achillessehnenruptur, gehören zum Alltag in der unfallchirurgischen Patientenversorgung. Die Inzidenz für die akute Achillessehnenruptur beträgt 21.5 bis 31 Fälle pro Menschen pro Jahr, wobei diese in den letzten Jahrzehnten deutlich angestiegen ist (LANTTO et al. 2015; GANESTAM et al. 2016; HOLLADAY et al. 2016; EGGER u. BERKOWITZ 2017). Sowohl die funktionell-konservative als auch die operative (offene u. minimalinvasive Chirurgie) Therapie sind mit langen Rehabilitations- und Ausfallzeiten für die Patienten verbunden (GWYNNE-JONES et al. 2011). Der Heilungsverlauf von Sehnengewebe ist im Vergleich zu dem anderer Gewebearten ein langsamer und komplikationsbehafteter Prozess. Eine Ursache dafür ist, dass das Sehnengewebe deutlich hypozellulärer und hypovaskulärer ist sowie eine geringere metabolische Aktivität als anderes Bindegewebe aufweist (CHEN et al. 2009; LIU et al. 2011). Neben den OP- assoziierten Risiken wie Wundheilungsstörungen, Infektionen und Re-rupturen sind die Bildung von unorganisierter extrazellulärer Matrix (ECM), Knorpelherden und heterotopen Ossifikationen (HO) in der Sehne häufige Komplikationen (KANNUS u. JÓZSA 1991; RILEY 2008). Unter HO versteht man die Bildung von maturem, trabekulärem Knochen außerhalb des Skelettsystems (BAIRD u. KANG 2009). Betroffene Patienten leiden häufig unter chronischen Schmerzen, Wundheilungsstörungen und vor allem Bewegungseinschränkungen in der operierten Sehne (ATESCHRANG et al. 2008; RICHARDS et al. 2008). Die Inzidenz für das Auftreten von HO in der Achillessehne variiert je nach Autor und Operationsmethode. Die niedrigste Inzidenz von 11,1% bis 14% liegt bei der perkutanen Versorgungstechnik (BLEAKNEY et al. 2002; ATESCHRANG et al. 2018). Bei der offenen chirurgischen Versorgung liegt die Inzidenz bei 14% bis 28% (KRAUS et al. 2004; ATESCHRANG et al. 2008), allerdings sind in einer weiteren Studie bei 62% der operierten Patienten Kalzifizierungen in der Achillessehne drei Jahre post OP ultrasonographisch nachweisbar gewesen (LEPPILAHTI et al. 1998). Auch bei der konservativen Behandlung können HO entstehen, wobei hier die Inzidenz noch unbekannt ist (HOLLENBERG et al. 2000). Ebenso entstehen HO unabhängig von 1

12 Einleitung einer Ruptur in der Achillessehne z.b. aufgrund chronischer Enthesiopathien (EGGER u. BERKOWITZ 2017) oder infolge genetischer Erkrankungen, wie der Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) (KAPLAN u. SHORE 2000). Bei anhaltenden Schmerzen oder Fraktur der Ossifikation ist die chirurgische Entfernung die einzig effektive Behandlung (Ross et al. 2014). Um einem Rezidiv vorzubeugen, ist eine anschließende lokale Bestrahlung oder die längere Gabe von nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs) notwendig (CULLEN u. PERERA 2009; KAN u. KESSLER 2011). Diese Behandlungen sind kostspielig und mit langen Rehabilitationszeiten verbunden, wobei der genaue Entstehungsmechanismus, der für die Bildung von HO verantwortlich ist, noch ungeklärt ist (KAN u. KESSLER 2011; ARORA u. ARORA 2015). Die canine/ feline Achillessehnenrupturen gehören im Vergleich zur Humanmedizin zu den seltenen orthopädischen Fällen und treten bevorzugt bei großwüchsigen Hunderassen auf (ISAKA et al. 2014) mit einem gehäuften Auftreten beim Labrador, Dobermann und Deutschen Schäferhund (PIERMATTEI et al. 2006). Vorrangig entsteht diese aus einem direkten Trauma (JOHNSTON u. TOBIAS 2017) oder die Sehne rupturiert bzw. teilrupturiert aufgrund chronisch degenerativer Veränderungen, beruhend auf Mikrotraumata und wiederkehrender Überbeanspruchung (JOPP u. REESE 2009; CERVI et al. 2010). Am häufigsten kommt es dabei zur nichttraumatisch bedingten Avulsionsruptur der Sehne des M. Gastrocnemius an Ihrer Insertion am Calcaneus (FAHIE 2005). Bei vollständiger Sehnenruptur ist die chirurgische Behandlung das Mittel der Wahl. Neben der Sehnennaht, wie der Three-Loop-Pulley-Naht oder der Locking-Loop-Naht (HARASEN 2006), ist die anschließender postoperative Fixierung des Sprunggelenkes mittels calcaneotibialer Zugschraube (KLINGLER u. FORTERRE 2016), transartikulärem Fixateur externe (MORSHEAD u. LEEDS 1984) oder Cast/ Schienenverband (GUERIN et al. 2018) für den Behandlungserfolg von großer Bedeutung. Die Prognose für das Tier ist nach operativer Behandlung als gut einzustufen (JOHNSTON u. TOBIAS 2017), allerdings unabhängig betrachtet von weiterer sportlicher oder arbeitsbedingter Nutzung. In einer kleinen neuseeländischen 2

13 Einleitung Studie sind 7 von 10 Hütehunde nach Achillessehnenruptur und anschließender OP voll arbeitsfähig einsetzbar gewesen (WORTH et al. 2004). Probleme in der tierärztlichen Behandlung stellen nach wie vor die relativ langen Rehabilitationszeiten von durchschnittlich 20.2 Wochen (NIELSEN u. PLUHAR 2006) und die hohe Komplikationsrate dar. In einer retrospektiven Studie von 45 caninen Patienten liegt diese bei 35 % (CORR et al. 2010) von 21 felinen Patienten bei 28,6 % (CERVI et al. 2010). Das Auftreten von Ossifikationen in der Achillessehne postoperativ sowie nach chronischen Achillessehnenverletzungen in der Kleintiermedizin wird zwar beschrieben (FOSSUM 2007), eine Studie gibt es in der zugänglichen Literatur bisweilen noch nicht. Ferner wurde der histologische Aufbau und die Biomechanik der caninen Achillessehne untersucht. Dabei zeigte sich, dass insbesondere im distalen Teil der Sehne des M. gastrocnemius, welcher als Prädilektionsstelle für die Ruptur gilt, vermehrt fibrokartilaginäres Gewebe vorhanden ist. Dieses könnte für die messbar schlechteren biomechanischen Eigenschaften (tensile load und maximum load to failure) der Sehne in diesem Bereich verantwortlich sein (JOPP u. REESE 2009). In diesem Bereich lassen sich auch vermehrt Mineralisationen röntgenologisch darstellen (HARASEN 2006). Neben der Pathophysiologie der Sehnenheilung sind die genauen zellulären Mechanismen, die zur Bildung von Knorpel oder auch Ossifikationen in der Sehne führen, noch weitgehend unbekannt. Aus diesem Grund ist die Forschung zu diesen Themen wichtig. Von möglichen Erkenntnissen könnten Human- und Veterinärmedizin gleichermaßen profitieren und diese könnten ferner die Grundlage für neue Therapieoptionen von traumatischen und degenerativen Sehnenverletzungen sein. 3

14 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Architektur des Sehnengewebes Sehnen dienen der Kraftübertragung zwischen Knochen und Muskulatur, weshalb ihre Anatomie und Physiologie stark von der mechanischen Belastung abhängig sind. Wie für Bindegewebe typisch, bestehen sie hauptsächlich aus organisierter extrazellulärer Matrix (ECM). Sie ist für die Haupteigenschaften von Sehnengewebe, wie Zugfestigkeit, Flexibilität und Elastizität, verantwortlich (MAGNE u. BOUGAULT 2015). Die ECM besteht primär aus parallel angeordneten Kollagenfasern. Diese sind in Faszikeln, Fibrillen, Subfibrillen, Mikrofibillen bis hin zur kleinsten Einheit dem Tropokollagen organisiert (LIN et al. 2004). Die einzelnen Kollagenfaserbündel werden von bindegewebigen Schichten, dem sog. Endotendineum, Epitendineum und Paratendineum umhüllt. Diese ermöglichen das reibungslose Aneinander-Gleiten der Faserbündel und versorgen das Sehnengewebe, indem sie Blutgefäße, Nerven und Lymphbahnen führen (LIN et al. 2004; LIPMAN et al. 2018). Die vornehmliche Kollagenart der Sehne ist Kollagen I, welches 75% der Trockenmasse der Sehne ausmacht. Kollagen I ist ein tripel-helikales Molekül, bestehend aus zwei α-1 Ketten sowie einer α-2 Kette. Die periodisch angeordnete wellenartige Struktur von Kollagen I Fasern, auch crimp genannt, ermöglicht die Konformationsänderungen der Sehne bei der Dehnung. Des Weiteren besteht die ECM zu einem kleinen Anteil aus Kollagen III, Proteoglykanen, wie Dekorin und Hyaluron und Glykoproteinen, und dem Faserprotein Elastin (FRANCHI et al. 2007; MAGNE u. BOUGAULT 2015; GUZZONI et al. 2018). Sehnengewebe ist im Vergleich zu anderem Bindegewebe zellarm (TOZER u. DUPREZ 2005). Die überwiegende Zellart sind die ovoiden Tenoblasten und spindelförmigen Tenozyten. Vereinzelnd finden sich auch Endothelzellen, Synovialzellen oder auch Chondrozyten in Regionen, wo Druck auf der Sehne lastet (FRANCHI et al. 2007). Tenoblasten und Tenozyten sind Sehnen-spezifische Fibroblasten bzw. Fibrozyten. Sie befinden sich frei beweglich zwischen den Kollagenfasern und produzieren Kollagen I, sowie andere ECM Moleküle, sodass sie funktionell wichtig für die Homöostase, das Remodeling und die Heilung der Sehne sind. Derzeit geht man davon aus, dass verschiedene Stimuli, wie z.b. Traumata oder vermehrte körperliche 4

15 Literaturübersicht Aktivität die Tenoblasten anregen, sich zu Tenozyten zu differenzieren. Diese proliferieren dann und bauen die ECM um, den neuen Umständen entsprechend angepasst (CHUEN et al. 2004; LIPMAN et al. 2018). 2.2 Entstehung von Heterotopen Ossifikationen in der Sehne Heterotope Ossifikationen in der Achillessehne entstehen aus dem Mechanismus der enchondralen Ossifikation (FENWICK et al. 2002; LIN et al. 2010). Derzeit ist dieser Entstehungsmechanismus wenig verstanden und es wird angenommen, dass viele verschiedene Faktoren diesen beeinflussen können. Extrinsische Faktoren können dazu beitragen, dass es zu Ca 2+ haltigen Ablagerungen innerhalb der ECM kommt (AGABALYAN et al. 2013; CAPPATO et al. 2020), zudem weiß man, dass eine Sehnenverletzung zum Einstrom von multipotenten Stammzellen aus dem Knochenmark führt (ZANTOP et al. 2006). Heute geht man aber davon aus, dass vor allem die lokalen Sehnenstammzellen, insbesondere die multipotenten Tendon derived progenitor cells (TDPCs), ursächlich sind. Diese Zellen bergen typische Stammzellcharakteristika in sich, wie die Fähigkeit der Selbsterneuerung, Koloniebildung, Klonogenität und die Multipotenz sich in andere Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten oder Osteoblasten zu differenzieren (BI et al. 2007; RUI et al. 2010; TAN et al. 2012; RUI et al. 2013; ZHANG et al. 2016). Die Differenzierung der Vorläuferzellen markiert den Beginn der enchondralen Ossifikation angestoßen wird der Prozess durch Einflussfaktoren, wie z.b. Veränderungen in der ECM, mechanische Fehlbelastung der Sehne oder Entzündung (siehe Abb. 1) (DURGAM u. STEWART 2016). Es kommt dann zur Formation von Knorpelanlagen, die zur Bildung von Osteoblasten führen, welche dann zunächst Geflechtknochen und später lamellären Knochen in der Sehne bilden. Im Folgenden werden die wichtigsten bekannten Faktoren und Entstehungsmechanismen aufgeführt. 5

16 Literaturübersicht Einflussfaktoren für die chondrogene Differenzierung von Vorläuferzellen Den Beginn der Entstehung von HO stellt die Differenzierung der Vorläuferzellen (TDPCs) zu Chondrozyten da. Nicht nur TDPCs haben das Potential sich in andere Zellen zu differenzieren, auch Tenozyten besitzen die verantwortlichen Gene und die Fähigkeit sich zu Adipozyten, Chondrozyten oder Osteoblasten zu differenzieren (MOS et al. 2007). Unter physiologischen Bedingungen wirken bestimmte Faktoren dieser Fehldifferenzierung entgegen, da dies die Homöostase des Sehnengewebes stark beeinträchtigen würde. In Abbildung 1 werden die verschiedenen Faktoren, welche die Differenzierungsrichtung der Zellen und die Entstehung von HO beeinflussen, aufgezeigt (MAGNE u. BOUGAULT 2015). Abb. 1: Differenzierungswege der TDPCs. Verschiedene Einflussfaktoren veranlassen die Differenzierung der TDPCs zu Tenozyten oder zu Chondrozyten bzw. Osteoblasten und initiieren die Entstehung von Knorpelanlagen (übersetzt und modifiziert nach MAGNE u. BOUGAULT 2015). 6

17 Literaturübersicht Als wichtiger Einflussfaktor ist die intakte, sehnen-spezifische ECM zu nennen. Tenozyten bzw. TDPCS benötigen dicht parallel angeordnete Kollagenfasern sowie eine zellarme Umgebung, um sich tenogen zu differenzieren (BI et al. 2007; YIN et al. 2010). Veränderungen in der ECM können dazu führen, dass die TDPCs mit einer anderen Zusammensetzung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren in Berührung kommen, wie z.b. mit BMP-2, welches dann über den Smad1-Smad5-Smad8- Signalweg zu einer vermehrten Expression von Runx2 (Runt-related transcription factor 2) führt. In der Folge kann mehr Ca 2+ und eine erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase festgestellt werden, was dann Ossifikationen in der Sehne zur Folge hat (BI et al. 2007). Des Weiteren gibt es einen weitgehend ungeklärten Einfluss anderer Zytokine und Wachstumsfaktoren, die im direkten Zell-Zell Kontakt ausgetauscht werden. In in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass bei Co-Kultur von MSCs mit Tenozyten bei Zugabe von Wachstumsfaktoren (IGF-1, TGF-β), die MSCs sehnenspezifische Marker hochregulieren, wie z.b. Tenomodulin, Skleraxis, Dekorin, β1-integrine und Marker für Kollagen I und III. Daraus schlossen die Autoren, dass für die tenogene Differenzierung Zell-Zell Kontakte mit Tenozyten nötig sind und Zytokine sowie Wachstumsfaktoren zwischen den Zellen ausgetauscht werden (SCHNEIDER et al. 2011). Weitere Faktoren, wie die sog. Growth and Differentiation Factors (GDF), dabei insbesondere GDF 5, 6 und 7, regen ebenfalls die TDPCs an, sich zu Tenozyten zu differenzieren und verhindern eine chondro-osteogene Fehldifferenzierung (HOLLADAY et al. 2016). Fehlen diese Zell-Zellkontakte und kommen Tenozyten/TDPCs in Kontakt mit knochenähnlicher Matrix, wird die chondrogene Differenzierung gefördert. Aus in vitro Versuchen weiß man ebenfalls, dass für die Differenzierung der TDPCs eine Dehnung der Zellmatrix nötig ist. Die in Bioreaktoren kultivierten TDPCs differenzieren sich bei einer zyklischen Spannung von 4% zu Tenozyten, wohingegen sie sich bei einer Spannung von über 8% zu Adipozyten, Chondrozyten oder Osteoblasten differenzieren (ZHANG u. WANG 2010; CHEN et al. 2017). Dies zeigt, dass eine moderate, angepasste Belastung für die Homöostase der Sehne essentiell ist. 7

18 Literaturübersicht Ähnlich wie bei den Veränderungen durch die ECM, konnte bei Entzündung ein erhöhter BMP-2 Level in der verletzten Sehne gemessen werden. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass eine Erhöhung des Prostaglandins E2 (PGE2) zu einer Aktivierung des o.g. BMP-2-Smad Signalweges führt, was dann letztlich die Bildung von Ossifikationen bedingt (ZHANG u. WANG 2012; ZHANG et al. 2016) Frühe Chondrogenese und Kollagen II Produktion Als erster Schritt der Chondrogenese kommt es zur Aggregation und Kondensation der Vorläuferzellen (z.b der TDPCs) über die Aktivierung des BMP-Signalweges (ZUSCIK et al. 2008). Dieser ist verantwortlich für die Expression mehrerer Zelladhäsionsmoleküle wie N-cadherin und N-cam und macht damit die Kondensation der Zellen erst möglich (OBERLENDER u. TUAN 1994; LIM et al. 2015). Wie in Abb. 2 dargestellt, beginnen die Vorläuferzellen danach den Transkriptionsfaktor Sox 9 (SRY-Box 9) hoch zu regulieren, welcher für die Expression von Knorpel spezifischen Genen, wie die der ECM Proteine Kollagen II (Col2A1) und Aggrecan (Agc), verantwortlich ist (BELL et al. 1997; ZUSCIK et al. 2008). Die Vorläuferzellen differenzieren sich weiter zu zunächst rundförmigen Chondrozyten. Diese produzieren die Knorpel-spezifische ECM, welche vornehmlich aus Kollagen II, dem Proteoglykan Aggrecan sowie Adaptor Proteinen wie Kollagen IX, verschiedenen Glykoproteinen wie COMPs (Cartilage oligomeric matrix Protein) und Matrilinen besteht (ROSENBERG et al. 1998; MUTTIGI et al. 2016). Wie bereits erwähnt, ist das vorherrschende Kollagen, welches von den Chondrozyten in der frühen Chondrogenese gebildet wird, das Kollagen II. Dieses faserbildende oder fibrilläre Kollagen ist ein Homotrimer aus drei α1 (II) Ketten (SHOULDERS u. RAINES 2009) und hat mehrere Funktionen: Es bildet ein fibrilläres Netzwerk und sorgt für die Viskoelastizität des Gewebes und ist wichtig für die Ernährung/Homöostase von Chondrozyten (YANG et al. 1997; LIM et al. 2015; XIN et al. 2015). Im Zuge der weiteren Chondrogenese kommt es zur forcierten Proliferation der Chondrozyten, diese bilden vermehrt ECM und so entsteht die Knorpelanlage (ZUSCIK et al. 2008). 8

19 Literaturübersicht Abb. 2: Stadien der Chondrogenese und ihre spezifischen Marker (modifiziert nach SUSZIK et al. 2008) Hypertrophe Differenzierung der Chondrozyten und Kollagen X Synthese Chondrozyten aus dem Zentrum der Knorpelanlage werden größer und beginnen sich weiter zu hypertrophen Chondrozyten zu differenzieren. Ein Schlüsselfaktor für die Differenzierung von Chondrozyten ist der Transkriptionsfaktor Runx 2 (Runt-related transcription factor 2) (YOSHIDA et al. 2004). Dieser bindet an die Promotor Region, welcher für die Bildung von Kollagen X (Col10A1) kodiert. Die Chondrozyten beginnen Kollagen X zu synthetisieren (LI et al. 2011). Das nicht fibrilläre, dafür netzbildende Kollagen X besteht aus Homotrimeren, welche aus drei α1(x) Ketten gebildet werden (ROSATI et al. 1994). Es wird davon ausgegangen, dass die hauptsächliche Funktion von Kollagen X die Umstrukturierung der ECM beinhaltet, um eine Kalzifizierung des Knorpels zu ermöglichen (KWAN et al. 1991). Die erhöhte Transkription von Kollagen X wird zeitgleich begleitet durch ein erniedrigtes mrna Level von Kollagen II, sodass bei terminal differenzierten Chondrozyten keine Sox 9 und Col2a Genexpression mehr vorliegt (sog. Col2a - Col10 + Chondrozyten) (TAM et al. 2018). Diese Chondrozyten sezernieren Matrixvesikel. Dieses sind extrazelluläre Strukturen, die ausgehend von der zytoplasmatischen Membran der Chondrozyten bis in die ECM reichen (HALE u. WUTHIER 1987). Über jene beginnt die Mineralisation des Knorpels (SHEN 2005). Mit Voranschreiten der Mineralisation kommt es zur verringerten Nährstoffdiffusion durch 9

20 Literaturübersicht die sich kalzifizierende Matrix, was zu einer erhöhten Sekretion von pro-angiogenen und osteogenen Wachstumsfaktoren führt (MACKIE et al. 2008). Sowohl die hypertrophen, als auch die terminal differenzierten Chondrozyten produzieren Vascular endothelial growth factor (Vegf), wodurch es zum Einsprießen neuer Blutgefäße kommt (LEE et al. 1998; HOJO et al. 2010). Über diese kommt es zum Einwandern von MSCs, welche sich dann zu Osteoblasten weiterdifferenzieren (ZHANG 2010). Für den Knorpelabbau sind vor allem Proteasen, wie Matrix Metalloproteasen (MMPs) von Bedeutung. MMP-13 wird hierbei direkt von den hypertrophen Chondrozyten exprimiert (siehe Abb. 2) (ORTEGA et al. 2004). Schließlich gehen die terminal differenzierten Chondrozyten in Apoptose über. Ihre zurückbleibende Knorpelmatrix fungiert als Platzhalter für die Bildung von Knochen über die sich differenzierten Osteoblasten und Osteoklasten (ZUSCIK et al. 2008). Ein Teil der Chondrozyten geht nicht in Apoptose über sondern differenziert sich weiter in Osterix + Knochenvorläuferzellen und trägt so ebenfalls dem Matrixumbau bei (YANG et al. 2014). Osteoblasten bilden die für Knochen charakteristische Kollagen-haltige ECM, welche dann über die Ablagerung von Hydroxyapatitkristallen mineralisiert (ZHANG 2010). 2.3 Tiermodelle zur Untersuchung von HO an Sehnen Erste Modelle zur Untersuchung der Entstehung von HO wurden bereits in den frühen 50iger Jahren angewendet (BUCK 1953). Häufig verwendete Tierarten sind dabei die Maus, die Ratte, das Schaf oder das Kaninchen (HASHIMOTO et al. 2007; NELSON et al. 2012). Angelehnt an der Klinik des Menschen werden dabei vorwiegend HO an der Patellarsehne, Rotatorenmanschette oder Achillessehne untersucht. Dabei kann zwischen zwei verschiedenen Arten von Modellen unterschieden werden: Zum einen Modelle, die die erworbenen HO aufgrund traumatisch/entzündlicher Ursachen darstellen. Zum anderen Modelle, die mithilfe transgener Tiere die Entwicklung von HO ohne traumatisch/entzündliche Ursache untersuchen Tiermodelle mit traumatisch/entzündlichen Ursachen für HO Ein einfaches und das am häufigsten verwendete Modell zur Untersuchung von HO an der murinen Achillessehne stellt die transversale Tenotomie da (BUCK 1953; ROONEY et al. 1992; LIN et al. 2010). In diesem Modell wird unter 10

21 Literaturübersicht Allgemeinanästhesie bei Ratten/Mäusen eine komplette Inzision der Sehne in ihrer Mitte durchgeführt. Die Sehnenstümpfe werden nicht readaptiert, sondern lediglich die Haut wird vernäht. Unabhängig vom Genotyp der verwendeten Mäuse konnte beispielsweise ZHANG (2016) knorpelige Vorstufen in den untersuchten Sehnen 2 Wochen post OP zeigen, HO konnten in den Präparaten 8 bis 10 Wochen post OP dargestellt werden. Diese wurden auch progressiv größer. Die HO in den Sehnen 25 Wochen post OP waren im Durchschnitt 2,5-fach voluminöser, als die HO in den Sehnen 10 Wochen post OP (ZHANG et al. 2016). Ein von O BRIEN (2012) angewandtes Modell ist noch einfacher und liefert ebenfalls verlässliche Ergebnisse hinsichtlich der Entstehung von HO. Dabei wird mit einer 23G Injektionsnadel eine Stickinzision in der Mitte der Achillessehne durchgeführt. Hierbei entsteht nur ein kleiner Riss in den Sehnenfasern, welcher zuverlässig im Zuge der Heilung HO entstehen lässt. Dieses Modell hat zusätzlich den Vorteil, dass direkt die biomechanische Testung der Sehnen durchgeführt werden kann, da nur einzelne Sehnenfasern beschädigt werden. HO entwickeln sich häufig im Zuge von schweren Brandverletzungen, Schädel-Hirn- Traumata oder auch Wirbelsäulenverletzungen (SHAFER et al. 2008; EVANS et al. 2014; PETERSON et al. 2014). Um dies möglichst kliniknah zu untersuchen, wurde das sog. Brain-traumatic/Burn/Tenotomy Model entwickelt (JU et al. 2018). Im Zuge dieses Modells wird bei Ratten unter Allgemeinanästhesie ein Knochenfenster im Parietallappen des Schädels entfernt und unter Schonung der Dura Mater ein stumpfes Hirntrauma zugefügt. Zusätzlich wird eine moderate standardisierte Brandverletzung auf dem Rücken und die Tenotomie der Achillessehne durchgeführt. Zehn Wochen post OP ließen sich bei allen Tieren HO in den Achillessehnen nachweisen. Die Injektion von chemisch reizenden oder aber auch osteogenen Substanzen in die Sehne führt ebenfalls zur Ausprägung von HO. HASHIMOTO et al. (2007) injizierten humanes rekombinantes BMP2 in die Sehne des M. flexor digitalis superficialis von Kaninchen und konnten bereits 2 Wochen später HO in der Sehne feststellen. Ebenso führt die Injektion von mit BMP4 transduzierten Stammzellen oder auch 11

22 Literaturübersicht humaner demineralisierter Knochenmatrix in die murine Achillessehne zu HO nach 4 Wochen (HANNALLAH et al. 2004) Tiermodelle mit transgenen Mäusen Um die angeborenen bzw. nicht entzündungsbedingte Entwicklung von HO zu untersuchen, wird mit transgenen Mausstämmen gearbeitet. Bei diesen transgenen Tieren wird versucht, den BMP-Signalweg zu beeinflussen. Tiermodelle, die eine erhöhte Aktivität eines BMP Rezeptors bewirken (KOBAYASHI et al. 2005; FUKUDA et al. 2006) oder bestimmte Inhibitoren des BMP-Signalweges ausschalten (TYLZANOWSKI et al. 2006) führen allerdings zu embryonaler Letalität und keiner Ausprägung von HO im Phänotypen. Das derzeit etablierteste Modelltier zur Untersuchung von HO ist die sog. Nse-BMP4 Maus. Bei diesem transgenen Mausstamm kommt es zur Überexpression von BMP4- Liganten unter Kontrolle des neuronenspezifischen Enolase-Promotors (Nse). Diese Tiere entwickeln mit ca. 8 Lebenswochen erste Anzeichen von HO im Weichgewebe, während die restliche Skelettogenese weitgehend unbeeinträchtigt bleibt. Dieses Tiermodell wird ebenfalls für die Untersuchung der Fibrodysplasia ossificans progressiva verwendet (KAN et al. 2004). Ein anderes Tiermodell führt über eine vermehrte Expression von BMP Ziel-Genen zur Entstehung von HO. Hier ist beispielsweise die vermehrte Ausprägung von dem Cbfa1-Gen (Core binding factor α1), auch unter dem Namen Runx2 (Runt-related gene 2) bekannt, zu nennen. Das Cbfa1 Protein ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor im BMP-Signalweg, indem es unter anderem die frühe Differenzierung von Osteoblasten und Bildung von Knochen bewirkt (DUCY et al. 1997; OTTO et al. 1997). Auch für dieses Tiermodell wurde ein Promotor verwendet, hier der Kollagen Typ II-Promotor (Col2a1-Promotor). Bei einer vermehrten Ausprägung dieses Genes mittels der Cbfa1 Maus kommt es zur früheren Ausbildung von enchondralen Ossifikationen im gesamten Stützgewebe (bereits um dem 18. embryonalen Entwicklungstag). Dies geschieht aufgrund einer verfrühten Reifung der Chondrozyten. Diese Tiere leiden allerdings unter Zwergwuchs und skelettalen Missbildungen (UETA et al. 2001). Im Allgemeinen gibt es derzeit viele Tiermodelle, die die entzündliche/traumatische 12

23 Literaturübersicht Entstehung von HO darstellen, jedoch wenig transgene Mauslinien zeigen die typische Entstehung von HO. Außerdem entstehen HO bei den transgenen Mäusen nicht nur in der Sehne, sondern auch in der Muskulatur, Haut oder auch Knochen (KAN u. KESSLER 2011). Die Verwendung und Weiterentwicklung von verschiedenen Modellen ist weiterhin unabdingbar, da die Entstehungsmechanismen von HO bislang nur im Ansatz verstanden sind (O'BRIEN et al. 2012). 2.4 Die Transmembranmoleküle Integrine Integrine gehören zu den sog. Zelladhäsionsrezeptoren. Dies sind transmembrane Glykoproteine, welche für die Signalübertragung zwischen Zellen untereinander oder den Zellen und der ECM verantwortlich sind (LUO et al. 2007). Neben der Signalübertragung verbinden sie das Aktinzytoskelett der Zelle mit der ECM und betten die Zelle somit in ihre Mikroumgebung ein. Adhäsionsmoleküle spielen eine essentielle Rolle bei der Entwicklung, Homöostase und Heilung von Gewebe (LIU et al. 2000; HUMPHRIES et al. 2006). Es sind vier Familien von Adhäsionsrezeptoren bekannt. Neben den Integrinen sind das die Cadherine, Selektine und Immunglobulin- Zelladhäsionsmoleküle (Ig-CAM) (APLIN et al. 1998). Integrine sind entwicklungsgeschichtlich sehr alt und sind erstmalig in den 80iger Jahren entdeckt worden und gelten seither als die am besten verstandenen Zelladhäsionsrezeptoren (TAMKUN et al. 1986; HYNES 1987; JOHNSON et al. 2009). Neben den o.g. Funktionen spielen sie eine zentrale Rolle für wichtige zelluläre Prozesse wie Adhäsion, Migration, Differenzierung, Proliferation und Apoptose (LIU et al. 2000). Integrine sind Heterodimere, deren α- und β- Untereinheiten nicht kovalent miteinander verbunden sind. In Vertebraten sind derzeit 18 α- und 8 β- Untereinheiten bekannt, welche insgesamt 24 verschiedene Integrine bilden, die sich hinsichtlich ihrer Struktur und Liganden unterscheiden (siehe Abb. 3 A). Der Grundaufbau der verschiedenen Integrine ist ähnlich (siehe Abb. 3 B). Sie besitzen eine große extrazelluläre Domäne, welche für die Bindung mit Liganden verantwortlich ist. Hier ist insbesondere der Kopfanteil wichtig oder auch N-terminale Region, der die beiden α- und β- Untereinheiten miteinander verbindet. Dieser besteht aus der βi Domäne der β Einheit, welche mit dem aus Aminosäuren-Segmenten bestehenden siebenflügeligen β- Propeller verbunden sind, und der αi Domäne (inserted domain) (BARCZYK et al. 13

24 Literaturübersicht 2010). Letztere wird nur bei der Hälfte der Integrine ausgebildet, wie z.b. bei Kollagen bindenden β1 Integrinen (LUO et al. 2007). Außerdem besitzen Integrine eine sehr kurze Transmembranhelix und eine kurze zytoplasmatische Domäne (außer Integrin β4), welche mit dem Aktinzytoskelett verbunden ist (LUO et al. 2007; BENNETT et al. 2009). Diese Struktur der Integrine erlaubt es ihnen mit einer Bandbreite von verschieden Liganden auf unterschiedliche Arten zu binden. Abb. 3: Familie und Struktur der Integrine (A) Darstellung der 24 verschiedenen Integrine in Vertebraten und ihrer Liganden (modif. nach MORENO-LAYSECA et al. 2019) (B) Repräsentative Darstellung eines Integrins mit αi Domäne (modif. nach BARCZY et al. 2010) Es gibt Integrine, die mit hoher Spezifizität an nur einen Liganden binden, wie z.b. Integrin α3/β1 nur an Laminin. Andere Integrine, wie z.b. Integrin α4/β1 können an verschiedene Liganden, wie z.b. Fibronektin, VCAM-1 oder Osteopontin binden (siehe Abb. 2 A). Die Integrinfamilie lässt sich in einzelne Gruppen sortieren, die Größte mit 12 Mitgliedern ist die der β1 Integrine. Hinsichtlich ihrer Ligandenspezifität binden einige β1 Integrine bevorzugt an Laminin (α3/β1, α6/β1, α7/β1), andere wiederrum an 14

25 Literaturübersicht Fibronektin (mit LDV oder RGD-Sequenz) (α4/β1, α5/β1, α8/β1, α9/β1) und letztlich welche an Kollagen (α1/β1, α2/β1, α10/β1, α11/β1) (HUMPHRIES et al. 2006; MORENO-LAYSECA et al. 2019) Das Integrin α2/β1 Das Integrin α2/β1 ist ein Rezeptor für viele Liganden, einschließlich verschiedener Kollagene, Laminin, Decorin, E-Cadherin, MMP-1, Endorepellin und auch einigen Virusstämmen, wie humanen Echo- oder Rotaviren (ZUTTER u. EDELSON 2007; JOKINEN et al. 2010). Das Integrin α2/β1 wird nicht ubiquitär, aber dennoch weitreichend von vielen verschiedenen Zelltypen exprimiert. Bis dato konnte es z.b. auf Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, einigen Zellen des hämatopoetischen Systems, wie aktivierten T-Leukozyten, Mastzellen, Neutrophilen Granulozyten und Blutplättchen nachgewiesen werden (ZUTTER u. SANTORO 1990; SIPILÄ et al. 2014; FOUGEROLLES et al. 2000; SIPILÄ et al. 2014). Eine sehr wichtige Rolle nimmt das Integrin α2/β1 als Kollagenrezeptor ein. Hier bindet es vorwiegend an Kollagen I, II, III, IV und V, wobei die größte Affinität zu Kollagen I besteht (KERN et al. 1993; NYKVIST et al. 2000; JOKINEN et al. 2004). Dies lässt sich darin begründen, dass Integrin α2/β1 im Gegensatz zu anderen Integrinen, nicht nur an die Monomere, sondern auch an die Fibrillen des Kollagen I bindet. Dabei ist zu wissen, dass Kollagen I unter physiologischen Bedingungen immer in fibrillärer Form vorliegt (JOKINEN et al. 2004). Damit es zu einer Bindung zwischen Kollagen I und Integrin α2/β1 kommen kann, ist die Aminosäurensequenz GFOGER (Glycin- Phenylalanin-Hydroxyprolin-Glycin-Glutaminsäure-Arginin) in der tripelhelikalen Struktur des Kollagens entscheidend. Diese Sequenz liegt nahe des N-Terminus, in der Mitte und am C-Terminus der Kollagen α-kette vor und wird von der αi Domäne des Integrins erkannt und gebunden (KNIGHT et al. 2000; XU et al. 2000). Für die Bindung ist außerdem die Anlagerung von dem 2-wertigen Kation Mg 2+ an die Metall Ion Depend Adhesion Site (MIDAS Region) an der Unterseite des β-propellers wichtig (JOKINEN et al. 2004). Folgende Zusammenhänge aus Zellkulturexperimenten mit Integrin α2/1β sind hinsichtlich Ossifikationsmechanismen von Bedeutung. Es ist gezeigt worden, dass Integrin α2/β1 die Genexpression von der Kollagenase MMP-1 hochreguliert, einem 15

26 Literaturübersicht Enzym, welches für die Matrix-Degradation und das Remodeling wichtig ist. Im Umkehrschluss konnte ebenfalls gezeigt werden, dass wenn die Zellen weniger Integrin α2/β1 exprimieren, auch das mrna Level der MMP-1 reduziert wird (RIIKONEN et al. 1995). Dies könnte für Veränderungen hinsichtlich des Kollagen- Umbaus sorgen. Außerdem konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, dass Stammzellen aus dem Knochenmark sich auf Kollagen I Matrix zu Osteoblasten differenzieren, dies aber über den Rezeptor Integrin α2/β1 vermittelt wird. Wird dabei die Funktion des Integrins mit einem Antikörper gegen Integrin α2/β1 deaktiviert, findet keine Osteoblastendifferenzierung statt (MIZUNO et al. 2000). Ähnliche Beobachtungen konnten auch XIAO et al. (1998) machen. Sie konnten zeigen, dass die Interaktion von Integrin α2/β1 mit Kollagen I wichtig für die Genexpression von Osteoblasten spezifischen Genen und auch der Mineralisation ist (XIAO et al. 1998). Zudem weisen Osteoblasten von ITGA2 -/- Mäusen eine höhere Expression von dem Enzym alkalische Phosphatase auf und haben eine höhere Genexpression von Kollagen I (STANGE et al. 2013). Ein Zusammenhang zwischen der Entstehung von HO und Integrinen ist nach derzeitigem Stand der Literatur allerdings noch nicht erforscht worden Die Integrin α2/β1 knockout Maus Die Integrin α2/β1 knockout Maus (ITGA2-/- Maus) wurde erstmalig im Jahre 2002 gezüchtet und charakterisiert (CHEN et al. 2002; HOLTKOTTER et al. 2002). Die Herstellung der ITGA2 -/- Maus basierend auf dem Cre/loxP System wird in Kapitel 3.2 beschrieben. Die ITGA2 -/- Mäuse entwickeln sich normal, sind vermehrungsfähig und sind hinsichtlich ihrer Phänotypen nicht von WT gleichen Alters zu unterscheiden. Außerdem sind Wurfgröße, Geburtsgewicht und /-größe der ITGA2-/- Mäuse vergleichbar mit denen von WT Mäusen (HOLTKOTTER et al. 2002). Bei der morphologischen und histologischen Untersuchung innerer Organe zeigten sich keine Abnormalitäten. Lediglich die Anzahl und Verzweigung der Drüsengänge in der Mamma ist bei den ITGA2-/- Weibchen geringer im Vergleich zu WT Weibchen, wobei kein Unterschied hinsichtlich des Brutverhaltens und der Laktation beobachtet werden konnte (CHEN et al. 2002). 16

27 Literaturübersicht In mehreren in vitro Studien wurde gezeigt, dass Integrin α2/β1 einer der wichtigsten Kollagenrezeptor an Blutplättchen ist und ein Ausschalten dieses Integrins zu einer stark verminderten Adhäsion von Blutplättchen zu Kollagen I führt (STAATZ et al. 1990; WATSON et al. 2000; CHEN et al. 2002). Dieses konnte in in vivo Studien aber nicht beobachtet werden. Die ITGA2 -/- Maus hat die gleiche tail bleeding time wie die WT Maus (CHEN et al. 2002; HOLTKOTTER et al. 2002). Es konnte in dem Zuge gezeigt werden, dass der Rezeptor Glykoprotein VI an den Thrombozyten die Anhaftung an Kollagen I bewirkt und unabhängig vom Integrin die Aufgabe übernimmt. ITGA2 -/- Mäuse zeigen bei Entzündungen die gleiche Anzahl an Entzündungszellen wie den T-Zellen, B-Zellen, NK Zellen, Neutrophilen Granulozyten, Monozyten und Makrophagen wie WT Mäuse. Bei kontrollierter Infektion mit Listeria monozytogenes konnte allerdings eine deutlich reduzierte angeborene Immunantwort festgestellt werden (ZUTTER u. EDELSON 2007). Es ist außerdem gezeigt worden, dass der native Knochen der ITGA2 -/- Maus Veränderungen im Vergleich zu dem der WT Maus aufweist. So enthält er mehr Kollagen Typ I und weist eine abweichende Fibrillenmorphologie sowie einen höheren Anteil von trabekulärem Knochen auf. STANGE (2013) lieferte hierfür folgenden Erklärungsansatz: Durch das Fehlen des Kollagen I Rezeptors Integrin α2/β1 können die Zellen das umliegende Kollagen I nicht bzw. weniger erkennen. Dieses gestörte cell-sensing führt im Umkehrschluss dazu, dass kompensatorisch mehr Kollagen I von den Knochen bildenden Zellen produziert wird. Letztlich führt dies zu einer geringeren Ausprägung von altersbedingter Osteoporose in der ITGA2 -/- Maus (STANGE et al. 2013). In einer weiteren Untersuchung aus der gleichen Arbeitsgruppe führte das Fehlen von Integrin α2/β1 in der frühen Phase der Frakturheilung zu einer früheren und stärkeren Ausprägung von Knorpel im Frakturspalt, der dann eher mineralisiert und letztlich zu einem größeren knöchernen Kallus mit einem erhöhten Gesamtkollagen wird (WENDLER 2020). Morphologische Abweichungen der Sehnen von ITGA2 -/- Mäusen sind bisweilen noch wenig erforscht. Vorarbeiten aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Richard Stange zeigen Veränderungen der nativen Sehnen von ITGA2 -/- Maus. So haben die Sehnen 17

28 Literaturübersicht im Vergleich zum WT in der Transmissionselektronenmikroskopie schmalere Kollagenfibrillen, die Anordnung der Kollagenfibrillen differiert zwischen den Genotypen hingegen nicht. In Zellkultur-Experimenten produzieren ITGA2 -/- Tenozyten mehr Kollagen, in vivo lässt sich allerdings kein erhöhter Kollagengehalt in den Sehnen nachweisen. Es konnte zudem in den Sehnen der ITGA2 -/- Tiere eine erhöhte proteolytische Aktivität festgestellt werden. Dies zeigt sich darin, dass in der Zymographie Marker proteolytischer Enzyme wie MMP2 und MMP9 hochreguliert sind und mittels ELISA ein erhöhter Gehalt an löslichen C-terminalen Kollagenfragmenten vorliegt. Beides ist ein Indikator dafür, dass in den Sehnen, wie auch in den Knochen der ITGA2 -/- Maus, ein erhöhter Kollagen Umbau stattfindet (KRONENBERG et al. 2020). Insgesamt zeigt die ITGA2 -/- Maus unter normalen, nicht experimentellen Bedingungen nur wenige morphologische und physiologische Abweichungen im Gegensatz zu den Ergebnissen von in vitro Studien. Es wird daher angenommen, dass in vivo andere Kollagen bindende Integrine und Zellrezeptoren den Verlust von Integrin α2/β1 kompensieren können (PETERS et al. 2012). 18

29 Fragestellung und Zielsetzung 2.5 Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, weitere Erkenntnisse über die Funktion des Integrins α2/β1 in Bezug auf die Entstehung von HO in der Sehne zu gewinnen. Die zentralen Fragestellungen lauten dabei wie folgt: 1.) Beeinflusst das Fehlen des Kollagen Rezeptors Integrin α2/β1 die Ausprägung und das Remodelling von Kollagen II und X, die im Zuge der Entstehung von HO gebildet werden? 2.) Gibt es zudem Unterschiede in der morphologischen Ausprägung der sich bildenden HO? 3.) Gibt es einen Unterschied zwischen einer altersbedingt erworbenen HO und einer postoperativ entstandenen HO in der Sehne? Zur Beantwortung der Fragen wird ein über das Cre/loxP System hergestelltes Mausmodell einer Integrin α2/β1 knockout Maus gewählt. Im ersten Teil der Arbeit wird ein kliniknahes Modell der End-zu-End-Sehnennaht an der murinen Achillessehne entwickelt. Die Entstehung von HO wird translational untersucht und mit bereits bestehenden Tiermodellen verglichen. Es werden dann anschließend die erworbenen HO von 24 Wochen alten Mäusen und auch die postoperativ entstandenen HO in der Sehne ausgewertet. 19

30 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Material Versuchstiere Die in Tabelle 1 aufgeführten Tiere wurden für den Tierversuch verwendet. Tab. 1: Auflistung der Versuchstiere Versuchstiere C57BL/6 ITGA2 -/- Maus Lieferant Harlan-Winkelmann, Borchen Klinik für Dermatologie, Universitätsklinikum Köln Geräte Die in Tabelle 2 aufgeführten Geräte wurden für die Versuche verwendet. Tab. 2: Auflistung verwendeter Laborgeräte Gerät Autoklav HV-25l Folienschweißgerät Gefrierschrank (-20 C) Gewebeinfiltrationsautomat (ASP6025) Inhalationsnarkosegerät UniVet Porta Kühlplatte Cool Plate Cop 20 Kühlschrank Micro-CT Skyscan 1176 Mikroskop Kamera, AxioCam ICc 1 Mikroskope: Stereo- Zoom-Mikroskop Stemi 2000-C Fluoreszenz- u. Lichtmikroskop BX 51 Mikroskop SFC-18 Paraffinausgießstation HistoStar Paraffin-Streckbad TFB PC für Auswertung PH-Meter MP125 Pipetten Hersteller HMC Europe, Engelsberg Hawo, Obrigheim Liebherr, Ochsenhausen Leica, Wetzlar Groppler, Deggendorf Medite, Berlin Liebherr, Ochsenhausen Bruker, Billerica, Massachusetts, USA Zeiss, Oberkochen Zeiss, Oberkochen Olympus, Hamburg Motic, Wetzlar Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA Leica, Wetzlar Duell Technologies, Round Rock, Texas, USA Mettler, Toledo Eppendorf, Hamburg 20

31 Material und Methoden Rotationsmikrotom RM2145 Rotlichtlampe Silver Crest Schermaschine Schüttler SM-30 Untersuchungslampe HL 1200 Vortexer Waage BL1505 Wärmeschrank Wärmeschrank 40 C Wasserbad Sonorex RK 100H Zentrifugen: Zentrifuge Galaxy mini Zentrifuge 4K15 Leica, Wetzlar Luxoplast, Ampfing Moser, Unterkirnach Edmund Bühler, Hechingen Heine, Herrsching VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA Sartorius, Göttingen Binder, Tuttlingen Binder, Tuttlingen Memmert, Schwabach VWR Intern., Radnor, Pennsylvania, USA Sigma, Osterode am Harz Chemikalien, Lösungsmittel und Medikamente Die in Tabelle 3 aufgeführten Substanzen wurden für die Versuche verwendet. Tab. 3: Auflistung verwendeter Chemikalien, Lösungsmittel und Medikamente Chemikalie/ Lösungmittel/ Medikament Aceton Alkohol: 99% 80% 70% 60% Aqua dest. Bepanthen Augen- und Nasensalbe Bovines Serumalbumin EDTA Eindeckmittel Eukitt Enthaarungscreme Flächendesinfektion Hämalaun nach Meyer Hautantiseptikum Isofluran, Forene Leitungswasser NaCl-Lösung 0,9% Hersteller AppliChem, Darmstadt Apotheke UK Münster Apotheke UK Münster Bayer, Leverkusen Carl Roth, Karlsruhe Carl Roth, Karlsruhe O. Kinddler, Bobingen Balea, Karlsruhe Hartmann, Heidenheim Carl Roth, Karlsruhe Schülke und Mayr, Noderstedt AbbVie, Ludwigshafen B.Braun, Melsungen Paraffin MCCormick Scientific, Maarn, Niederlande 21

32 Material und Methoden PBS Rimadyl Xylol Biochrom, Berlin Zoetis, Berlin J.T. Baker, Center Valley, PA, USA Puffer und Lösungen Die Zusammensetzung der angewandten Puffer und Lösungen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Soweit nicht anders angegeben, wurden sie mit Aqua dest. angesetzt und der ph-wert mit NaOH oder HCL eingestellt. Tab. 4: Auflistung und Zusammensetzung verwendeter Puffer und Lösungen Bezeichnung Zusammensetzung Paraformaldehyd (4%) 40 g Paraformaldehyd ad 1 L 1 x PBS (ph 7,2) ph bei 7,2 einstellen und bis Gebrauch bei - 20 C lagern Sörensen-Phosphat Puffer Stammlösung A: 0,1 M Kaliumdihydrogenphosphat (13,61 g KH 2PO 4 /l Aqua dest.) Stammlösung B: 0,1 M Dinatriumhydrogenphosphat (17,8 g Na 2HPO 4 2 H 2O / l Aqua dest.) Vor Gebrauch werden Stammlösung A und B im Verhältnis 1:4 gemischt und auf ph von 7,38 eingestellt. TBS-Puffer Gebrauchslösung 9,0 g Tris (121,1 g/mol) + 68,5 Tris-HCl (157,6 g/mol) + 87,8 g NaCl (58,4 g/mol) auf 1000 ml Aqua dest. und den ph auf 7,4-7,6 einstellen. Vor Gebrauch 1:10 mit Aqua dest. verdünnen Färbemittel, Proteasen und industrielle Kits Tab. 5: Auflistung verwendeter Färbemittel und industrieller Kits Färbemittel Alcianblau 8 GX DAB-Substrat, SigmaFast TM Tabletten Dako Animal Research Kit TM, Peroxidase Hämalaun nach Meyer Herovici`s Collagen Stain Kit Histologiefarbe, Tissue Marking Dyes Hersteller Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Steinheim Dako, Glostrup, Dänemark Roth, Karlsruhe American MasterTech, Lodi, Kalifornien, USA BioGnost, Zagreb, Kroatien 22

33 Material und Methoden Hyaluronidase 0,1% Kernechtrot Methylgrün Protease XXIV 0,05% Sigma-Aldrich, Steinheim Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Steinheim Sigma-Aldrich, Steinheim Antikörper Für die immunhistochemische Untersuchung sind die in Tabelle 6 aufgelisteten Primärantikörper verwendet worden. Tab. 6: Auflistung verwendeter Antikörper Antikörper Typ Hersteller Kollagen II Klon 6B3 Maus IgG, monoklonal Millipore, Schalbach Kollagen X Klon X53 Maus IgG, monoklonal Quartett, Berlin Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien Die in Tab. 7 aufgelisteten Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialien sind verwendet worden. Tab. 7: Auflistung der verwendeten Hilfsmittel und Verbrauchsmaterialen Hilfsmittel/ Verbrauchsmaterialien Messröhrchen, 10 ml Einbettkassetten Einmalhandschuhe Filterpads Filterpapier für Einbettkassetten Gewebemarkierungsfarbe Kanülen Leukoplast Mikro-Federschere Mikro-Nadelhalter Mikrotom-Messer Objekträger Superfrost Plus Hersteller Eppendorf, Hamburg Langenbrinck, Emmendingen B.Braun, Melsungen Bio Optica, Italien, Milano Medite, Burgdorf Biognost, Zagreb, Kroatien Becton Dickinson, Heidelberg BSN medical, Hamburg B.Braun, Melsungen B.Braun, Melsungen Feather, Osaka, Japan Menzel, Braunschweig OP-Tuch grün Mölnlycke Health Care, Göteborg, Schweden PDS II 7-0 Ethicon, Johnson & Johnson Medical, Norderstedt 23

34 Material und Methoden Pinzette Pipetten Prolene 6-0, 5-0 Skalpell Fig.15 Spritze Tupfer Merten, Palingen Eppendorf, Hamburg Ethicon, Johnson & Johnson Medical, Norderstedt Feather, Osaka, Japan Becton Dickinson, Heidelberg Fink u. Walter, Merchweiler Computersoftware Die in Tab. 8 aufgelistete Software wurde verwendet. Tab. 8: Auflistung verwendeter Computersoftware Software cellsense Dimension Excel 2016 Hersteller Olympus, Hamburg Microsoft, Redmond, Washington, USA GraphPad PRISM Graph Pad Software Inc., La Jolla, Kalifornien, USA MB-Ruler 5.3 MB-Softwaresolutions, Iffezheim Skyscan 1167 control software CTAn (64-bit) CTVox (64-bit) NRecon (64-bit) DATAVIEWER (64-bit) Bruker,Billerica, Massachusetts, USA 24

35 Material und Methoden 3.2 Versuchstiere Für die Forschungsarbeit wurden insgesamt 80 männliche Mäuse des Inzuchtstammes C57BL/6 (WT) der Firma Jackson Laboratory (Bar Habour, Maine, USA) verwendet. Außerdem wurden 49 männliche Integrin α2 knockout Mäuse (ITGA2-/-) verwendet, die auf dem Hintergrund der C57BL/6 gezüchtet wurden (HOLTKOTTER et al. 2002). Die Herstellung der ITGA2-/- Maus basiert auf dem Cre/loxP System. Dafür wird ein Genabschnitt durch das Einbringen bestimmter Basensequenzen (loxp- Stelle) markiert und dann später von dem Enzym Cre-Rekombinase erkannt, herausgeschnitten und damit inaktiviert. Für die Herstellung der ITGA -/- Maus wird ein Mausstamm generiert, bei dem vor und hinter dem ersten Exon des ITGA2 Gens sowie dem Startbereich für die Transkription, eine loxp-stelle eingefügt wird (ITGA2 gefloxte Maus). Diese Maus wird verpaart mit einer transgenen Maus, bei der die Cre- Rekombinase in das Genom eingebracht wurde. Dabei erhält man heterozygote Nachkommen, bei denen die loxp markierte Stelle im Genom herausgeschnitten ist, was zu einem funktionellen Verlust des ITGA2 Gens führt. Die heterozygoten Tiere werden erneut verpaart, um homozygote ITGA2 -/- Tiere zu erhalten. Alle verwendeten Mäuse wurden in der zentralen tierexperimentellen Einrichtung der medizinischen Fakultät in Münster gezüchtet und der Tierversuch fand gemäß den Tierschutzrichtlinien des Landesamtes für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen statt (Aktenzeichen A310). 3.3 Gruppeneinteilung Für die Untersuchung von HO in der nativen Sehne wurden ausschließlich adulte männliche Mäuse im Alter von Wochen verwendet mit einem Gewicht von 28,32g ± 2,14 g. Dabei wurden 7 WT und 9 ITGA2-/- Mäuse untersucht. Für die Untersuchung von HO in der Sehne nach operativer Tenotomie wurden ebenfalls männliche Tiere in einem Alter von 8 bis 13 Wochen mit einem Mindestgewicht von 20 g verwendet. Die Einteilung der Gruppen ist Tab. 9 zu entnehmen. Die geringere Tierzahl bei der Auswertung ist durch postoperative Komplikationen wie Lockerung/ Ausriss der Cerclage oder vermehrte Entzündung bedingt. Diese Tiere wurden aus dem Versuch genommen. Außerdem sind beispielsweise für den 4 und 6 Wochen Zeitraum zeitgleich biomechanische Testungen der Sehnen durchgeführt 25

36 Material und Methoden worden, weshalb diese nicht für die histologische Untersuchung zur Verfügung standen. Deswegen erhöhte sich hier die Tierzahl der WT-Mäuse zu diesem Zeitpunkt. Vorab sind für die Etablierung und Evaluierung der verwendeten Operationsmethode insgesamt 49 Mäuse verwendet worden. Tab. 9: Gruppeneinteilung für den operativen Tierversuch Genotyp Heilungszeitpunkt post Anzahl der Tiere OP (in Wochen) WT ITGA2-/ n= 43 n= Operativer Eingriff an Versuchstieren Um die postoperative Entstehung von HO in der Sehne untersuchen zu können, wurde ein möglichst kliniknahes Modell der End-zu-End-Sehnennaht entwickelt. Hierbei können die dynamischen Vorgänge der Sehnenheilung unter Einfluss von Nahtmaterial und postoperativer Immobilisation untersucht werden. 26

37 Material und Methoden Abb. 4: Aufbau für den Tierversuch (A) Operativer Eingriff in Bauchlage unter dem Stereomikroskop in Isofluran-Vollnarkose. (B) Das Sprunggelenk wurde auf einer Erhöhung fixiert, sodass eine Dorsalflexion des Gelenkes von 30 erreicht wird. Wie in Abbildung 4 gezeigt, erfolgte der operative Eingriff unter dem Stereomikroskop. Zunächst wurde eine Tenotomie der linken Achillessehne durchgeführt. Nachfolgend wurden die Sehnenstümpfe readaptiert durch eine 2-fache Kernnaht modifiziert nach Lange (Abb. 5). Diese Nahttechnik ist eine Abwandlung der Kirchmayr-Kessler Naht und ist erstmals so angewandt worden von Max Lange 1929 (LANGER et al. 2015). Zur Fixierung des Sprunggelenkes wurde eine Fadencerclage angelegt, sodass eine maximale Dorsalextension im Sprunggelenk von 30 erreicht werden konnte. Zu verschiedenen Zeitpunkten (1,2, 4, 6, 16 Wochen) sind die Tiere getötet und die Achillessehnen präpariert worden. Abb. 5: Schematische Darstellung der 2-fachen Kernnaht modif. nach Lange 27

38 Material und Methoden Vorbereitung und Anästhesie Die Operationen fanden im Institut für Muskuloskelettale Medizin statt. Die verwendeten Tiere wurden ausschließlich für den Tierversuch gezüchtet und waren den täglichen menschlichen Kontakt und Umgang gewöhnt. Vor der Operation wurde das jeweilige Tier gewogen und in die Induktionskammer des Narkosegerätes gesetzt. Anschließend folgte die Narkoseeinleitung mit 4-5 Vol.% Isofluran bei 600 ml/min Sauerstoffzufuhr. Nach Eintritt der Bewusstlosigkeit wurde das Tier mit der Nase in die Maske auf dem Operationsfeld gelegt. Die Erhaltungsdosis für die Narkose betrug 2 bis 2,5 Vol.% bei einer Sauerstoffrate von 100 ml/min. Anschließend folgte die subkutane Injektion von 4 µg/g KGW Carprofen (Rimadyl, Pfizer, Berlin) und die Fixierung des Tieres in Bauchlage mit Leukosilk. Um ein Austrocknen der Augen zu verhindern, wurde Bepanthen Augen- und Nasensalbe appliziert. Während der gesamten Operation lag das Tier unter einer Wärmelampe, um einer Hypothermie vorzubeugen. Das linke Hinterbein wurde mit Enthaarungscreme depiliert und anschließend über eine sterile Erhöhung gelegt, sodass das Sprunggelenk gebeugt gelagert wurde (siehe Abbildung 4B). Dies ermöglichte das spätere Anbringen der Cerclage. Zuletzt erfolgte die Desinfektion der Haut. 28

39 Material und Methoden Operatives Vorgehen Die einzelnen Operationsschritte können Abbildung 6 entnommen werden. Abb. 6: Übersicht der Operationschritte (A) Sicht auf das Bein in (6,5 x Vergrößerung). (B) Tenotomie der Achillessehne 2 mm proximal des Ansatzes (10 x Vergrößerung). (C) Einbringen der Cerclage durch tibiofibulare Gabel. (D) Erste Kernnaht der Achillessehne (PDS 7-0). (E) Zweite Kernnaht (PDS 7-0). (F) Cerclage wird unterhalb Plantaraponeurose geführt und festgezogen. Zunächst erfolgte die Inzision von Haut und Faszie mit einem 15er Skalpell medial der Achillessehne vom Calcaneus bis zum muskulo-tendinösen Übergang der Sehne reichend. Anschließend folgte das stumpfe Freilegen der Sehne vom Ursprung am M. gastrocnemius bis zum Ansatz am Calcaneus. Während der gesamten Operation ist die Sehne und das umherliegende Bindegewebe mit steriler Kochsalzlösung feucht gehalten worden. Die Plantarissehne (Sehne des M. flexor digitalis superficialis) windet sich von medial nach plantar über die Achillessehne. Diese wurde vorsichtig angehoben und reseziert bis zur Fersenbeinkappe. Danach wurde die Achillessehne 2 mm proximal ihrer Insertionsstelle am Calcaneus mit dem Skalpell durchtrennt (Abb. 6 B). Um die spätere Naht zu schonen, erfolgte anschließend das Einbringen der Fadencerclage mit einem nicht resorbierbaren Faden (Prolene 5-0). Dieser wurde proximal durch die tibiofibulare Gabel geführt und zunächst so belassen (Abb. 6 C). Anschließend folgte die Readaptation der Sehnenstümpfe. Dazu wurde zunächst eine 29

40 Material und Methoden Kernnaht modifiziert nach Lange mit einem resorbierbaren Faden (PDS 7-0) verwendet (Abb. 6 D). Dabei wurde stets darauf geachtet, dass die jeweils medialen und lateralen Sehnenstümpfe aufeinanderlagen. Aus Vorversuchen zeigte sich, dass eine 4-Strangnaht die Reißfestigkeit der Naht deutlich erhöhte und somit wurde eine weitere Kernnaht modif. nach Lange (PDS 7-0) angebracht (Abb. 6 E). Zum Schluss erfolgte das distale Einbringen der Cerclage unterhalb der Plantaraponeurose plantar des Calcaneus (Abb. 6 F). Durch die erhöhte Lagerung des Sprunggelenkes wurde eine Flexion von 30 Grad erreicht und diente zur Orientierung bei dem Verknoten der Cerclage (siehe Abb. 4 B). Diese erlaubte postoperativ zunächst nur eine eingeschränkte Bewegung des operierten Beines und damit nur eine geringe Belastung der operierten Sehne. Eine vollständige Immobilisation des Beines wurde nicht gewählt, denn es ist bereits gezeigt worden, dass eine frühe Mobilisation zu einer verbesserten Heilung führt (PALMES et al. 2002). Mit dem gewählten Modell war den Tieren eine eingeschränkte aktive Mobilisation des operierten Beines erlaubt. Abschließend folgte der Verschluss von Faszie und Haut mit Einzelknopfnähten (Prolene 6-0) und das Anlegen eines Wundverbandes. Die Narkosedauer für den operativen Eingriff betrug 40 bis max. 60 min pro Tier Postoperative Nachsorge Postoperativ erhielten die Tiere Carprofen (4 µg/g KGW alle 24 h) für jeweils 3 Tage subkutan in die Nackenfalte injiziert. Zudem wurden die Tiere täglich begutachtet und in den ersten drei Tagen post OP sowie zweimal wöchentlich anhand eines Score Sheets zur Überwachung der Tiere gemäß dem Tierversuchsantrag untersucht. Dabei wurden Gewichtszunahmen /-abnahmen ermittelt und der Allgemeinzustand, das Spontanverhalten und der Zustand der Operationswunde in Punkten bewertet. Außerdem wurden das Gangbild und der Sprunggelenkwinkel des operierten Beines untersucht, um eine Lockerung/ Ausriss der Cerclage zu erkennen. All dies ermöglichte eine engmaschige Beurteilung der Gesundheit und Belastung der Tiere. Die Haltung der Tiere erfolgte in Gruppengrößen von 2 bis max. 5 Geschwistertieren, bei einer konstanten Raumtemperatur von 21 C, einer Luftfeuchte von 65 % und einem 12 h Hell- Dunkel- Rhythmus. Außerdem hatten die Tiere ad libitum Zugang zu 30

41 Material und Methoden Leitungswasser und einem Alleinfuttermittel und es wurden Nistmaterial sowie Unterschlupfmöglichkeiten aus Karton angeboten Tötung und Entnahme von Gewebeproben Entsprechend der verschiedenen Heilungszeitpunkte wurden die Tiere mit Isofluran narkotisiert und nach Eintritt der Bewusstlosigkeit mittels zervikaler Dislokation getötet. Beide Hinterbeine wurden anschließend exartikuliert und abgetrennt. Zur Überprüfung der postoperativen Immobilisation, wurde die maximale Dorsalflexion des linken Sprunggelenkes ermittelt. Dafür wurde der linke Oberschenkel unterhalb des Stereomikroskopes fixiert und das Sprunggelenk mithilfe einer Pinzette unter leichtem Druck maximal gebeugt. Davon wurde eine Mikrofotographie angefertigt und der Winkel im Anschluss über das optische Programm MB-Ruler (MB-Softwaresolutions, Iffezheim) ermittelt. Zur weiteren Gewebeaufbereitung wurden die Hinterbeine geschoren und die Haut des gesamten Beines mit Pinzette und Mikro-Federschere vorsichtig abpräpariert und die Operationswunde sowie der Heilungszustand inspiziert. Anschließend wurden beide Hinterbeine in 4%igem Paraformaldehyd für 12 h bei 7 Celsius fixiert. Um dieses auszuwaschen, gelangten die Proben danach für mind. 12 h in Sörensen- Phosphatpuffer auf dem Schüttler. Es folgte dann die Untersuchung der Beine im µ- CT. 3.5 µ-ct Untersuchungen Mittels Mikro- Computertomographie (µ-ct) wurde das Knochenvolumen der HO in der Sehne quantifizierbar dargestellt. Die Untersuchung erfolgte direkt nach der Präparation und Paraformaldehydfixierung der linken und rechten Hinterbeine. Dafür wurde ein speziell für die präklinische Forschung entwickelter, hochauflösender Computertomograph der Firma Bruker verwendet (SkyScan 1176, Bruker, Billerica, Massachusetts, USA). Für den Scan wurden die Beine in feuchte Tupfer eingewickelt und in Eppendorf Messröhrchen auf dem Probentisch in das CT Gerät gelegt, um ein Verrutschen oder Austrocknen der Proben während des Scans zu verhindern. 31

42 Material und Methoden Untersuchungsablauf Über die Steuerungssoftware des Herstellers wurde zunächst die Region of interest (ROI) für den Scan eingestellt, die sich distal ab den Metatarsalknochen bis proximal zum Kniegelenk belief. Es wurde die gerätmaximale Auflösung von 9 µm verwendet, bei einem 0,2 mm Aluminiumfilter, einer Spannung von 45 kv und einer Stromstärke von 500 µa sowie einem Rotationswinkel von 0,5. Im Anschluss des Scans wurde die Rekonstruktion mit der Herstellersoftware NRecon zur Umwandlung der Sensordaten (Messdaten) in auswertbare Schichtbilder durchgeführt Quantitative Auswertung der Ossifikationen Die Beine wurden zunächst senkrecht in allen 3 Ebenen ausgerichtet mit der herstellereigenen Software DATAVIEWER. Mithilfe der Herstellersoftware CTAn konnten die rekonstruierten Schichtbilder anschließend ausgewertet werden. Es wurde jeweils die Tibialänge und das Knochenvolumen /-oberfläche der HO ermittelt. Abb. 7: Auswertung des Knochenvolumens (A) Röntgenbild des linken Hinterbeines im Längsschnitt. (B) Querschnitt durch den Tibiakörper (roter Pfeil) und HO (roter Stern). (C) Auswertung des Knochenvolumens der HO im binärisierten Schnittbild innerhalb der schwarz unterlegten ROI. (D) Es wurden die Verknöcherungen proximal des Calcaneus bis zur tibiafibulären Gabel ausgewertet (rotes Viereck). Im Längsschnitt wurde die Tibialänge des linken und rechten Hinterbeins ermittelt (Abb.7 A). Dann wurde in den einzelnen rekonstruierten Querschnittsbildern manuell eine ROI um die HO gelegt (Abb.7 C). Es wurden pro Hinterbein im Durchschnitt

43 Material und Methoden Bildebenen analysiert. Aufgrund der geringeren Knochendichte der HO, waren sie gut von Calcaneus/Tibia abgrenzbar. Für die Auswertung wurden die Schichtbilder binarisiert und anhand eines Schwellenwertverfahrens (thresholding) ausgewertet. Dabei wurde ein Grausstufenbereich von 55 bis 255 berücksichtigt und auf dieser Grundlage das Knochenvolumen /-oberfläche der HO errechnet. Es wurden lediglich die Ossifikationen im Verlauf der Achillessehne ausgewertet, also ab dem proximalen Ende des Calcaneus bis zum Beginn der tibiofibulären Gabel. Somit wurden nicht der Knochenumbau bzw. die erosiven Effekte der Fadencerclage am Calcaneus und Tibia/Fibula mit einberechnet (Abb. 7 D). Die bildliche Darstellung der Beine erfolgte anschließend mit dem herstellereigenen Programm CTVox. 3.6 Histologische und immunhistochemische Färbungen Vorbereitung der Proben für die Histologie Zur Untersuchung des Heilungsverlaufes und der Entstehung von HO auf zellulärer Ebene sind histologische Feingewebsschnitte angefertigt worden. Nach dem µ-ct folgte die Präparation und Herausnahme der Achillessehne unter Zuhilfenahme des Stereomikroskopes. Dafür wurde zuerst die Fadencerclage durchtrennt und herausgezogen und die Achillessehne von Bindegewebe freipräpariert unter Schonung des Granulationsgewebes im Bereich des Tenotomiespaltes. Die Sehne wurde an ihrem muskulären Ursprung sowie an ihrem Ansatz mitsamt des Calcaneus abgetrennt und entnommen. Der Bereich zwischen den beiden Sehnenstümpfen wurde dorsal mit Histologiefarbe grün markiert, dies diente der besseren Orientierung beim späteren Schneiden im Paraffinblock. Um eine Beschädigung oder Abknicken der dünnen Sehne zu vermeiden, wurde die Sehne zunächst in feuchtes Filterpapier gewickelt und mitsamt einem Filterpad in die Einbettkassette gelegt Herstellung von Paraffinschnitten Die Sehnenproben mussten zunächst in Na-EDTA entkalzifiziert werden, damit das spätere Schneiden der Verknöcherungen im Paraffinblock möglich war. EDTA bildet dabei besonders stabile Chelatkomplexe mit Kalzium, welches somit dem Knochen entzogen wird. Dafür wurden die Proben für einen Zeitraum von 6 Wochen in 20 %iger Na-EDTA Lösung auf dem Schüttler gelagert, wobei die Lösung dreimal wöchentlich 33

44 Material und Methoden erneuert wurde. Abschließend wurden die Proben für mind. 12 h in Sörensen-Phosphatpuffer gewaschen. Für das Einbetten der Proben in Paraffin wurde der Gewebeinfiltrationsautomat verwendet. Dabei ist streng zu beachten, dass das Sehnengewebe nicht zu lange in Ethanol und Xylol inkubiert, da die Präparate sonst steif und brüchig werden. Im Automaten erfolgte zunächst die möglichst schonende Entwässerung der Proben. Dafür wurden sie für jeweils 1 h in 70, 90 und 96%igen Ethanol und anschließend dreimal für jeweils 1 h in 100%igen Ethanol gespült. Darauf wurden die Proben in 3 aufeinander folgenden Inkubationsschritten bei 63 C für jeweils 1 h in Xylol imprägniert und anschließend folgte die dreimalige Inkubation für jeweils 1h in C warmen Paraffin. Das endgültige Einbetten der Proben in Paraffin erfolgte dann an der Paraffinausgießstation. Dafür wurden die Sehnen senkrecht stehend eingebettet, sodass die spätere Schnittebene in der Transversalebene verlief und somit Querschnitte der Sehnen entstanden. Zur leichteren Orientierung wurde dabei immer das Ende mit dem muskulären Ursprung zuerst eingebettet. Danach wurden die Paraffinblöcke gekühlt gelagert. Am Rotationsmikrotom wurden 5 µm große Serienschnitte der Sehe hergestellt, wobei eine regelmäßige Kühlung der Paraffinblöcke bei -12 C auf einer Kühlplatte notwendig war. Für die standardisierte Auswertung waren die Schnitte in der Region wichtig, in der die Tenotomie durchgeführt wurde. Somit wurden vom proximalen Spaltrand aus, die fünf ersten Schnitte weiter distal verworfen und die darauffolgenden fünf bis 10 Schnitte verwendet, je nach Breite des Tenotomiespaltes. Die Schnittpräparate wurden darauf in 53 C warmen Paraffin-Streckbad geglättet und auf Objektträger aufgebracht und für mind. 12 h bei 37 C getrocknet. Für die Durchführung aller folgenden histologischen und immunhistochemischen Färbungen wurden die Schnittpräparate zunächst dreimal für jeweils 5 min in Xylol entparaffiniert und für jeweils 2 min in der absteigenden Alkoholreihe (2 x 100, 96, 90, 80, 70%) rehydriert und anschließend in Aqua dest. gestellt. Nach der jeweiligen Färbung folgte die Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe für jeweils wenige Sekunden in 70, 80, 90, 96% und für jeweils zweimal 1 min in 100%igen Ethanol. 34

45 Material und Methoden Anschließend gelangten die Präparate für 2 x 5 min in Xylol und wurden mit einem Eindeckmedium für wasserfreie Präparate (Eukitt) eingedeckelt und bei Raumtemperatur getrocknet Histochemische Färbungen Übersichtsfärbung Hämatoxylin Eosin Um die Heilung nach verschiedenen Zeitpunkten (1,2,4,6,16 Wochen) morphologisch zu untersuchen, wurde eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) durchgeführt. Dafür wurden die Paraffinschnitte, wie in Kapitel beschrieben, zunächst entparaffiniert und rehydriert. Anschließend gelangten die Schnitte für 5 min in Aqua dest. und für weitere 5 min in die Färbelösung Hämalaun nach Mayer. Dieser Farbstoff hat niedrigen ph und ist positiv geladen. Somit färbt er basophile Strukturen, wie Zellkerne, Knorpel und verkalktes Gewebe, spezifisch blau. Das sog. Bläuen wurde verstärkt, indem die Schnitte für 15 min in fließendes Leitungswasser gestellt wurden. Anschließen gelangten die Schnitte für 3 min in 1%iges Eosin, einem neg. geladenen Farbstoff, welcher acidophile Strukturen, wie z.b. Zellplasma, Bindegewebe und Muskulatur, rot färbt. Die Schnitte wurden darauf für nur 10 sec. in Aqua dest getaucht und anschließend, wie im vorigen Kapitel beschrieben, gewässert und eingedeckelt. Darstellung des Heilungsverlaufes mittels Herovici-Färbung Um die Kollagenproduktion im Tenotomiespalt zu vergleichen, wurden die Paraffinschnitte mittels dem Herovici Kollagen Färbe Kit (American MasterTech, Lodi, CA, USA) angefärbt. Die Kombination aus Pikro-Methylblau und Pikro-Säurefuchsin erlaubt eine differenzierte Blaufärbung von neu gebildetem Kollagen (typischerweise Kollagen Typ III) und Rotfärbung von dichter angeordneten maturen Kollagen (Kollagen Typ I). Somit kann die Kollagenproduktion und /-umwandlung im Zuge der Sehnenheilung dargestellt werden, wobei initial das ungerichtet angeordnete Kollagen III gebildet wird, welches dann durch Kollagen I ersetzt wird. Für die Färbung wurden die Paraffinschnitte zunächst für 2 x 5 min. in Xylol entparaffiniert und für jeweils 1 min in 96, 80 und 70 % igem Alkohol rehydriert. Anschließend wurden sie für eine weitere Minute unter fließendem Leitungswasser gewässert und für 5 Minuten in Weigert s Hämatoxylin gefärbt. Es folgte ein kurzes Auswaschen mit 35

46 Material und Methoden Leitungswasser (45 sek.) und das 2-minütige Färben in der Herovici Gebrauchslösung. Dann wurden die Schnitte für 1 min in 1%ige Essigsäure getaucht und für jeweils 1 min in aufsteigender Alkoholreihe (70, 80, 96 % iger Alkohol) dehydriert und anschließend für 3 x 1 min in Xylol überführt. Zuletzt erfolgte das Eindeckeln mit Eukitt. Darstellung von Knorpel mittels Alcianblau Färbung nach Mowry Im Zuge der Entstehung von HO in der Sehne kommt es zunächst zur Bildung von hyalinem Knorpelgewebe, welches mithilfe der Alcianblau-Färbung gefärbt werden kann. Bei dem niedrigem ph-wert von 2,5 kann der Farbstoff selektiv die sauren Mukosubstanzen der Extrazellulären Matrix des Knorpels binden und färbt diese cyan. Für die Färbung wurden die Paraffinschnitte zunächst in Xylol entparaffiniert und mit der absteigenden Alkoholreihe rehydriert (siehe Kap ) und dann für 5 min in Aqua dest. gestellt. Darauf gelangten die Schnitte für 3 min in 3%ige Essigsäure und anschließend für 30 min in Alcianblau (1g Alcianblau 8 GX in 100ml 3%iger Essigsäure bei ph 2,5). Zur Entfernung überschüssiger Farbe wurden die Schnitte erneut kurz in 3%iger Essigsäure gespült und anschließend für 2 min in Leitungswasser überführt. Für die Gegenfärbung wurden die Schnitte für 5 min in Kernechtrot-Gebrauchslösung gestellt und anschließend für 3 min in Aqua dest. gespült. Abschließend wurden die Schnitte entwässert und mit Eukitt eingedeckelt Immunhistochemische Färbungen Detektion von proliferierenden Chondrozyten mittels Kollagen II und hypertrophen Chondrozyten mittels Kollagen X Die immunhistochemische Färbung von Kollagen II und X verlief, bis auf die Verwendung unterschiedlicher Primärantikörper, identisch. Im Folgenden werden die Färbeschritte für beide Färbungen zusammen erläutert. Die Paraffinschnitte wurden zunächst entparaffiniert und rehydriert, wie in Kapitel beschrieben. Darauf folgte das Waschen der Schnitte in 1 x TBS für 3 x 5 min. Für die Demaskierung der Antigene in der Knorpelmatrix war eine zweimalige enzymatische Vorverdauung notwendig. Dafür wurden die Schnitte zunächst für 10 min bei 37 C in 0,05%iger Protease XXIV inkubiert. Nach einem erneuten Waschen mit TBS wurden die Schnitte mit 0,1% iger Hyaluronidase für 90 min bei 37 C vorverdaut und wieder 36

47 Material und Methoden mit TBS gewaschen. Um eine Hintergrundfärbung durch die endogene Peroxidase Aktivität des Gewebes zu verhindern, wurden die Schnitte für 5 min mit 0,3 % H2O2 inkubiert. Darauf folgte das Waschen mit TBS und die Schnitte konnten der Antikörperbehandlung zugeführt werden. Die Detektion von Kollagen II bzw. X in den knorpeligen Vorstufen der HO wurde mithilfe des Dako Animal Research Kit TM (Darko, Glostrup, Dänemark) durchgeführt. Dieses ermöglicht primäre Antikörper, welche aus Mausserum gewonnen wurden, auch auf Maus-Gewebeschnitten anzuwenden. Vor der Anwendung des primären Anti-Kollagen II bzw. X Antikörpers wurde dieser separat mit dem Biotinylierungsreagenz des Dako Kits versetzt. Dieses enthält einen biotinylierten, sekundären Anti-Maus Fab-Antikörper, der mit dem primären Antikörper einen Komplex bildet. Pro Präparat (50 µl) wurden dafür 1 µl Anti-Kollagen II bzw. X Antikörper mit 1 µl Biotinylierungsreagenz in 48 µl Aqua dest für 15 min bei RT inkubiert. In Vorversuchen zur Etablierung der Färbung war eine Antikörperkonzentration von 1:50 ausreichend. Nach Ablauf der Inkubation wurden 2 µl blocking Reagenz der Lösung hinzugefügt, welches Mausserum enthält. Die darin enthaltenen Immunglobuline binden freie, ungebundene, biotinylierte Antikörper, was ebenfalls zur Reduktion von unspezifischen Hintergrundfärbungen beiträgt. Anschließend wurde die Lösung auf die Schnittpräparate pipettiert und für 15 min bei RT inkubiert. Darauf folgte ein sorgfältiges dreimaliges Waschen der Schnittpräparate in TBS und das Aufbringen der Streptavidin-HRP-Gebrauchslösung des Dako Kits auf die Präparate für 15 min bei RT. Dieses führt zur Bildung von Biotin-Streptavidin- Komplexen. Für das spezifische Anfärben der Komplexe wurde anschließend DAB- (3.3 Diaminobenzidintetrahydrochlorid) Substratlösung auf die Schnitte pipettiert. Die an das Streptavidin gebundene Peroxidase setzt das Substrat um, sodass sich innerhalb von 3 bis 5 min die Kollagen II und X markierten Regionen braun färben. Anschließend konnten die Präparate zum Abstoppen der Färbereaktion in Aqua dest. überführt werden. Zur Verbesserung des Kontrastes wurde anschließend eine Gegenfärbung mit Methylgrün durchgeführt, dafür wurden die Schnitte für 90 sec. in die Färbelösung 37

48 Material und Methoden getaucht und in der aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Zuletzt erfolgte das Eindeckeln mit Eukitt. Eine Negativkontrolle der Färbung wurde ebenfalls durchgeführt, dabei wurde der primäre Anti-Kollagen II bzw. X Antikörper durch einen unspezifischen monoklonalen Antikörper ersetzt Quantitative Auswertung Die histologisch und immunhistochemisch gefärbten Schnitte wurden mithilfe des Fluoreszenz- und Lichtmikroskopes BX 51 (Olympus, Hamburg) eingescannt und mit der Software cellsense Dimension (Olympus, Hamburg) ausgewertet. Wie bereits in Kapitel beschrieben, wurden ausschließlich Schnitte aus dem Tenotomiespalt untersucht. Mithilfe des Programms konnten die spezifisch angefärbten Bereiche im histologischen Schnitt bestimmten Farbpixeln zugeordnet werden und somit quantitativ erfasst werden. Abb. 8: Auswertung der histologischen Präparate (A) Kollagen II gefärbter Gewebeschnitt mit umrandeter Gesamtfläche. (B) Der Kollagen II gefärbte Bereich wurde spezifisch rot markiert und kann in Verhältnis zur Gesamtfläche gestellt werden. Zunächst wurde die Gesamtfläche des Gewebeschnittes manuell umrandet und ermittelt (Abb. 8 A). Anschließend wurde das Programm, je nach Färbung, auf die bestimmten Farbpixel der Kollagen II bzw. X markierten Stellen kalibriert. Die 38

49 Material und Methoden entsprechenden Stellen wurden als ROI rot markiert (Abb. 8 B). Die Fläche der ROI wurde mit der Gesamtfläche des Gewebeschnittes ins Verhältnis gesetzt. 3.7 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mithilfe des Programme Microsoft Excel 2019 (Microsoft, Redmond, Washington, USA) und Graph Pad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA). Die Ergebnisse werden als Mittelwerte und Standardabweichung angegeben. Aufgrund der insgesamt niedrigen Tierzahl darf bei den ermittelten Werten nicht von einer Gauß schen Normalverteilung ausgegangen werden. Aus diesem Grund ist ein nicht-parametrischer, zweiseitiger Mann-Whitney- U- Test für unabhängige Stichproben zur Berechnung des Signifikanzniveaus herangezogen worden. Als statistisch signifikant sind Werte mit p 0,05 angenommen worden. 39

50 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Evaluation der Operationsmethode Im Folgenden wird zunächst das verwendete Modell der operativen Tenotomie evaluiert. Dafür wurden die klinischen Untersuchungen der Tiere, die Operationsdauer sowie die Messung des Sprunggelenkwinkels ausgewertet. Um das Modell auf histologischer Ebene zu untersuchen, wurden HE-Übersichtsfärbungen der Sehnenquerschnitte angefertigt und bewertet Klinische Untersuchung und Kontrolle der operierten Tiere Die Tiere zeigten am ersten Tag post OP ein geringgradig bis in Einzelfällen mittelgradig herabgesetztes Allgemeinbefinden bei normal erhaltenem Fressverhalten und überwiegender Entlastung des operierten Beines. Das Putz- und Lokomotionsverhalten war ebenfalls bereits am Folgetag nahezu unbeeinträchtigt. Spätestens ab dem dritten Tag post OP konnte bei keinem Tier mehr Schmerzsymptome laut der Mouse Grimace Scale (LANGFORD et al. 2010) festgestellt werden und die Tiere zeigten ein ausgeprägtes Nestbaubauverhalten. Die operierte Gliedmaße ist Tier individuell ab dem dritten bis vierten Tag, spätestens ab dem siebten Tag post OP wieder voll belastet worden. Je nach Immobilisationsgrad durch die Cerclage, zeigten die Tiere nach dem 21. bis 30. Tag post OP ein unbeeinträchtigtes Gangbild. Die Haut um die Naht war für circa drei Tage post OP leicht gerötet. Bei keinem der Tiere trat eine schwere Infektion des operierten Beines auf und es musste bei keinem Tier der Versuch wegen schlechtem Allgemeinbefinden abgebrochen werden. Die Gewichtskontrolle erfolgte bis fünf Tage post OP täglich, danach einmal in der Woche. Bei der Inspizierung des Beines post mortem war eine Spaltbildung zwischen den Sehnenstümpfen von mehr als 0,3 mm bei 10 von 76 operierten Tieren (entspricht 13,15%) ersichtlich, bei den anderen Tieren war keine größere Spaltbildung makroskopisch sichtbar. Insgesamt wurden die Versuchsergebnisse von sechs Tieren aufgrund Ausriss/ starker Lockerung der Fadencerclage und zu großer Spaltbildung und von zwei Tieren infolge andauernder Entzündungsreaktion bis sieben Tage post OP aus der Bewertung genommen, da sich 40

51 Ergebnisse die Versuchsparameter zu stark unterschieden. Diese Herausnahme der Versuchsergebnisse von 8 der insgesamt 76 Tiere entspricht einem Anteil von 10,5% Operationsdauer In Abb. 9 wird die Dauer der Operation dargestellt. Zunächst zur Etablierung des OP- Modells und letztlich für den eigentlich verwendeten OP-Versuch (2-fache Kernnaht modifiziert nach Lange und tibiofibuläre Fadencerclage). Abb. 9: Operationsdauer in Minuten verwendet zur Modelletablierung (n= 37) und für den späteren OP-Versuch (n= 73) (Mann-Whitney-U-Test, dargestellt werden MW ± SD, p**** <0,0001) Die OP-Dauer wird über den Zeitraum der Narkoseeinleitung bis zur ersten Spontanbewegung bemessen. Bei der Modelletablierung zeigte sich eine durchschnittliche OP-Dauer von 82,43 ± 21,23 min, bei dem eigentlichen OP-Versuch eine Dauer von 56,13 ± 12,52 min. Eine deutliche Lernkurve ist anhand der signifikanten Abnahme der OP-Dauer und der geringeren Varianz ersichtlich Postoperative Messung des Sprunggelenkwinkels Um die Immobilisation des operierten linken Beines zu überprüfen, wurde die maximale Dorsalflexion des Sprunggelenkes ermittelt. Dafür wurde das Bein vor der Präparation unter leichtem Druck gebeugt und mittels Mikrofotografie der Winkel der Dorsalflexion gemessen. Die Tiere, bei denen es eine zu starke Lockerung (Flexion von über 120 ) oder Ausriss der Cerclage gab, wurden nicht für die Auswertung der HO verwendet, da die Versuchsparameter zu stark abwichen. Nach der µ-ct Untersuchung zeigten diese Tiere zudem deutlich weniger HO, als die Tiere, bei denen das Bein stärker immobilisiert worden war. Die Probenzahl war allerdings zu gering, um 41

52 Ergebnisse einen statistischen Zusammenhang zwischen Mobilitätsgrad und Ausmaß der HO herzustellen. In Abb. 10 werden die Sprunggelenkwinkel nach unterschiedlichen Heilungszeitpunkten dargestellt. Abb. 10: Darstellung des Sprunggelenkwinkels zu verschiedenen Zeitpunkten. Vor der Präparation wurde mittels einer Mikrofotographie die maximale Dorsalflexion des linken Sprunggelenkes ermittelt (Kruskal-Wallis-Test, dargestellt sind MW ± SD, n 9, p** < 0,01) Aus Abb. 10 ist zu entnehmen, dass der Winkel im Sprunggelenk nach den verschiedenen Heilungszeitpunkten zunahm, trotz starker individueller Abweichungen innerhalb der Gruppen. Dies erlaubte eine kontinuierliche Mehrbelastung des operierten Beines. Bei den Tieren 1 Woche post OP zeigte sich ein Mittelwert von 42,06 ± 29,17. Hierbei zeigten 3 von 9 operierten Tieren einen Sprunggelenkwinkel von unter 30. Bei diesen Tieren erfolgte eine Überkorrektur durch ein zu festes Anziehen des Knotens. Ein solcher Effekt konnte bei den späteren Heilungszeitpunkten nicht mehr festgestellt werden. 2 Wochen post OP errechnet sich ein Mittelwert von 57,30 ± 20,08, 4 Wochen post 42

53 Ergebnisse OP 59,42 ± 12,20 und schließlich 6 Wochen post OP 64,63 ± 12,01 zu diesen Zeitpunkten gab es nicht so ausgeprägte Schwankungen innerhalb der Gruppen. Nach 16 Wochen post OP wies der Winkel einen Mittelwert von 83,26 ± 27,37. Es zeigte sich bei 5 von 13 Tieren dieser Gruppe eine deutliche Lockerung der Cerclage, jedoch keinen Ausriss jener Histologische Untersuchung des Heilungsverlaufes Um den Heilungsverlauf darzustellen, wurde eine HE-Färbung der Querschnitte aus dem Tenotomiespalt angefertigt. Dies diente der Untersuchung der verwendeten Operationsmethode auf histologischer Ebene. Die runden Löcher im Schnittpräparat sind durch das Fadenmaterial bedingt. Abb. 11: Darstellung des Heilungsverlaufes auf histologischer Ebene (A) Zwei Wochen post OP zeigten sich Chondrozyten ähnliche Zellen, die sich in Gruppen anordnen. Außerdem deuten fusiforme Zellen auf Fibroblasten hin. (B) Vier Wochen post OP kam es zur weiteren Ausbildung von hyalinem Knorpel. (C) Im Querschnitt oberhalb des Tenotomiespaltes zeigte sich degeneriertes, vollkommen azelluläres Sehnengewebe. HE-Färbung, Wildtyp, Vergrößerung unteres Bild 3,5x. In der frühen Heilungsphase (eine Woche post OP) überwog die Invasion von Entzündungszellen (dabei vorrangig polymorphkernige neutrophile Granulozyten) und eine massive Zunahme von Bindegewebe im Tenotomiespalt. Zur differenzierten Benennung der einzelnen Entzündungszellen (Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten) und zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion wäre allerdings eine spezifische immunhistochemische Anfärbung notwendig. Zwei 43

54 Ergebnisse Wochen post OP zeigten sich vermehrt Chondrozyten ähnliche Zellen mit basophilen Zellkernen, welche sich in Gruppen angeordnet haben (Abb. 11 A). Über den gesamten Schnitt verteilt waren spindelförmige Zellen, was für Fibroblasten ähnliche Zellen spricht. Außerdem konnten vereinzelnd neugebildete Nerven und Blutgefäße vor allem im peripheren Bindegewebe histologisch dargestellt werden. Bei den Präparaten vier Wochen post OP zeigten sich wenig Granulationsgewebe sowie kaum Entzündungszellen. Hier überwog die weitere Differenzierung von Knorpelgewebe mit deutlicher Ausbildung von Chondronen mit einer homogenen, strukturlosen Interterritorialsubstanz (Abb. 11 B). Auch war die beginnende Ossifikation in den meisten Schnitten sichtbar. In den Präparaten sechs Wochen post OP waren vermehrt degenerierte Chondrozyten, aber auch die Ausbildung von zellreichem Geflechtknochen zu erkennen. Dieser differenzierte sich weiter, sodass in den Präparaten 16 Wochen post OP nahezu ausschließlich mineralisierter Knochen mit ausgeprägten Markhöhlen zu finden war. Auf histologischer Ebene gab es bei den Präparaten stets eine Spaltbildung, d.h. die durch die Naht readaptierten Sehnenstümpfe standen nicht im direkten Kontakt miteinander, obwohl bei der Präparation der Sehne unter dem Stereomikroskop kein Spalt ersichtlich war. Das Fadenmaterial (PDS) war auch nach 16 Wochen post OP nicht resorbiert. In Abbildung 11 C ist ein Querschnitt oberhalb des Tenotomiespaltes zu sehen, hier zeigt sich die Interaktion von Sehnengewebe und Nahtmaterial. Es ist deutlich zu erkennen, dass das Sehnengewebe durch die Naht seine ursprüngliche Architektur verloren hat. Die Sehnenfasern sind lose und ungerichtet angeordnet, anstatt in eng verpackten Kollagenfaserbündeln mit bindegewebigen Septen. Es ist zudem auffallend, dass die Sehnen vollkommen azellulär sind. Dieses degenerierte Sehnengewebe findet sich in den Schnitten aller Heilungszeitpunkte wieder. Auch nach 16 Wochen zeigt sich histologisch kein neu gebildetes Sehnengewebe. Um die Kollagenproduktion bzw. -umwandlung im Tenotomiespalt zu untersuchen, wurde die sog. Herovici Färbung durchgeführt. Hierbei handelt es sich erneut um eine Übersichtsfärbung, bei der von jedem Genotyp zu jedem Heilungszeitpunkt jeweils drei Tiere untersucht wurden. 44

55 Ergebnisse Abb. 12: Darstellung der Kollagenproduktion im Heilungsverlauf. Die Herovici-Färbung markiert initial gebildetes Kollagen III blau sowie später gebildetes Kollagen I rot. Untersucht wurden Schnitte aus dem Tenotomiespalt, jeweils 3 Tiere pro Genotyp und Zeitpunkt. Es zeigte sich kein Unterschied in der blau-rot Abstufung zwischen WT und ITGA 2-/-. Wie bereits bei der Auswertung der HE-Schnitte beschrieben, ist nach der operativen Tenotomie kein neues Sehnengewebe im Laufe der Heilung gebildet worden. Da der ITGA2 knockout zu einem funktionellen Verlust des Kollagen I Rezeptors führt, ist die Kollagensynthese im Narbengewebe zu den verschiedenen Heilungszeitpunkten dennoch interessant. Nach der Auswertung der Herovici-Schnitte fand bei beiden Genotypen (WT vs. ITGA2-/-) eine ähnliche, graduierte Umwandlung von Kollagen III zu Kollagen I statt. Nach spätestens vier Wochen war das gesamte Gewebe im Tenotomiespalt rot gefärbt (siehe Abb. 12), bis auf die Bereiche, in denen hyaliner Knorpel vorlag. Diese Färbung gibt einen Hinweis darauf, dass sich der Beginn und das Ausmaß der Kollagen I Produktion zwischen den Genotypen nicht unterscheidet. Zur weiteren Differenzierung und Kontrolle der Herovici Färbung ist jedoch eine immunhistochemische Differenzierung von Kollagen I und III notwendig. Leider war die Etablierung der Antikörper für Kollagen I und III nicht zuverlässig erfolgreich. 4.2 Untersuchung der heterotopen Ossifikationen an nativen Sehnen Untersuchung von WT und ITGA2-/- hinsichtlich Körpergewichts und Tibialänge Es wurde die Entstehung von HO an nativen Sehnen verglichen. Dafür wurde zunächst überprüft, ob sich die Genotypen hinsichtlich Körpergewicht (KGW) und Tibialänge morphologisch unterscheiden. 45

56 Ergebnisse Abb. 13: Vergleich von Körpergewicht in (A) und Tibialänge (B) zwischen den WT und ITGA2- /-Es wurden Wochen alte männliche Tiere untersucht. (Mann-Whitney-U-Test, dargestellt sind MW ± SD, n 7) Hinsichtlich des Körpergewichtes (WT: 27,41 ± 1,202 g, ITGA2-/-: 29,03 ± 2,4934 g) und der Tibialänge (WT: 17,51 ± 0,2224 mm, ITGA2-/-: 17,22 ± 0,5302 mm) gab es keinen Unterschied zwischen WT und ITGA2 -/- (Abb. 13). Dies ist Voraussetzung, um die beiden Genotypen miteinander zu vergleichen. Ein höheres Körpergewicht sowie eine andere Tibiamorphologie hätten eventuell unterschiedliche Zug- und Druckkräfte auf die Achillessehne zu Folge, was dann die Entstehung von HO beeinflussen könnte Morphometrische Analyse der HO an nativen Sehnen Um die Entstehung von HO an der nativen Sehne zu untersuchen, wurden die jeweils linken und rechten Achillessehnen von Wochen alten männlichen Mäusen mittels µ-ct untersucht. Auffallend war, dass die Tiere entweder auf dem linken oder dem rechten Hinterbein größere Verknöcherungen aufwiesen, selten waren diese bilateral symmetrisch ausgeprägt. Somit wurde für die Berechnung der Mittelwert aus beiden Hinterbeinen pro Tier berücksichtigt. 46

57 Ergebnisse Abb. 14: Vergleich der HO an nativen Sehnen (A) µ-ct Bild von linken Hinterbeinen. (B) Vergleich des Knochenvolumens der HO in mm³. Es wurde die durchschnittliche Verknöcherung beider Hinterbeine bei Wochen alten männlichen Mäusen untersucht (Mann-Whitney U-Test, hier dargestellt Median, IQT, Min/Max, **p <0,01, n 7) Es konnte gezeigt werden, dass sowohl die WT als auch die ITGA2-/- Tiere im adulten Alter HO in beiden Achillessehnen ausbilden, unabhängig von einem operativen Eingriff. Dabei hatten die nativen Sehnen der ITGA2-/- Tiere hoch signifikant mehr HO als die der WT Tiere (p=0,003). Für das Knochenvolumen der HO der WT Tiere lässt sich ein Mittelwert von 0,0176 ± 0,0306 mm³ errechnen und für das der ITGA-/- Tiere ein Mittelwert von 0,0581 ± 0,037 mm³. Ein statistischer Zusammenhang zwischen Körpergewicht und ausgebildetem Knochenvolumen besteht nicht. 4.3 Untersuchung der HO an operierten Sehnen Um die Entstehung von HO nach der Sehnenoperation zu untersuchen, wurden µ-ct Untersuchungen der jeweils linken Hinterbeine 2, 4, 6, und 16 Wochen post OP durchgeführt. Zwei Wochen post OP konnten noch keine HO im Verlauf der Achillessehne bei beiden Genotypen festgestellt werden (Abb. 15). Es zeigten sich dafür in jedem Präparat Knochen auflösende Prozesse an der tibiofibulären Gabel und am Calcaneus. Diese sind aufgrund der Fadencerclage bedingt. Zudem können auch operativ bedingte Manipulationen am Knochen durch das Anbringen der Fadencerclage nicht ausgeschlossen werden. Diese erosiven Prozesse am Knochen waren vier Wochen 47

58 Ergebnisse post OP stärker ausgebildet. Nach sechs und 16 Wochen waren diese Bereiche allerdings wieder vollständig ossifiziert mit glatter Oberfläche. Nach vier Wochen konnte das Auftreten von HO im Verlauf der Achillessehne beobachtet werden. Die initiale Entwicklung der HO war entweder im Bereich des Sehnenansatzes am Calcaneus oder im Bereich der operativen Tenotomie festzustellen. Es gab eine deutliche Zunahme der HO nach sechs Wochen und nach 16 Wochen bei allen Tieren. In der vergleichenden Betrachtung der HO bei den nicht operierten Tieren fallen mehrere Beobachtungen auf: Die nicht operierten Tiere weisen deutlich weniger Ossifikationen in ihrer Sehne auf (Abb. 14 A). Jene Tiere waren dabei in dem gleichen Alter (23 25 Wochen), wie die Tiere, die im Alter von acht Wochen operiert wurden und deren Sehnen 16 Wochen später untersucht wurden. Außerdem ist anzumerken, dass die Ossifikationen bei den nicht operierten Tieren eine deutlich glattere Oberflächenstruktur aufwiesen und aufgrund der Grauwertstufen im µ-ct-bild gibt es einen Hinweis darauf, dass sie auch stärker mineralisiert waren. Bei der Analyse der rekonstruierten Bilder in der Transversal-, wie auch Longitudinalebene gibt es einen deutlichen Hinweis darauf, dass die ITGA2-/- Tiere in den Zeiträumen 4, 6 und 16 Wochen post OP vermehrt HO ausbilden. Eine genauere morphometrische Analyse folgt in Kapitel

59 Ergebnisse Abb. 15: Vergleich von HO an operierten Sehnen Dargestellt werden die jeweils linken operierten Hinterbeine im Zeitverlauf von 2, 4, 6 und 16 Wochen post OP. Nach 2 und 4 Wochen überwiegen die knochenauflösenden Effekte bedingt durch die Cerclage. Danach weisen die ITGA2 -/- Tiere mehr HO im Bereich der Achillessehne auf. 49

60 Ergebnisse Morphometrische Analyse der HO an operierten Sehnen In Abb. 16 wird die morphometrische Analyse des Knochenvolumens der HO dargestellt. Abb. 16: Knochenvolumen der HO an operierten Sehnen im Zeitverlauf (One way Anova, MW ± SD, * p<0,05, ** p<0,01, n 5) Sowohl beim WT als auch bei der ITGA2 -/- zeigt sich, dass das Knochenvolumen der HO im Zeitverlauf signifikant zunimmt (WT 4 Wochen: MW 0,08 ± 0,06 mm³ ggü. WT 16 Wochen: MW 2,36 ± 0,93 mm³, ITGA2 -/- 4 Wochen: MW 0,41 ± 0,66 mm³ ggü. ITGA2 -/- 16 Wochen: MW 3,38 ± 0,86 mm³). Es bestehen hohe individuelle Schwankungen innerhalb der Gruppen, die Tierzahlen betragen zwischen fünf und sieben Tieren pro Gruppe. Mithilfe der einseitigen Anova lässt sich der Trend darstellen, dass die HO des ITGA 2 -/- ein erhöhtes Knochenvolumen zu jedem Untersuchungszeitpunkt aufweisen Auswertung der immunhistochemischen Untersuchung In den histologischen Querschnitten wurde der hyaline Knorpel als Vorläuferstadium der HO untersucht. Zur generellen Übersicht wurde zunächst eine Alcianblau-Färbung angefertigt. Um die zunächst entstandenen hypertrophen Chondrozyten spezifisch anzufärben, wurde eine Kollagen II Färbung durchgeführt. Um die sich später differenzierenden, proliferierenden Chondrozyten anzufärben, wurde eine Kollagen X 50

61 Ergebnisse Färbung durchgeführt. Somit kann eine Aussage über den Differenzierungsgrad des Knorpels zu den verschiedenen Heilungszeitpunkten gestellt werden. In den Sehnenpräparaten eine Woche post OP ließ sich weder über die Alzianblaufärbung, noch über immunhistochemische Verfahren Kollagen II haltiges Gewebe darstellen. Die Kollagen II Färbung war für die Zeitpunkte zwei und vier Wochen post OP positiv und die Untersuchung auf Kollagen X war für die Zeitpunkte vier und sechs Wochen post OP positiv. In den Präparaten sechs Wochen post OP befand sich nahezu ausschließlich bereits ossifiziertes Gewebe und kein knorpelhaltiges Gewebe mehr. Die Ossifikationen selbst lassen sich nicht mehr spezifisch anfärben, da das Gewebe für die histologische Untersuchung entkalkt worden war. Abb. 17: Kollagen II Anteil 2 Wochen post OP. Gemessen wurde der prozentuale Anteil von Kollagen II positiven Knorpel an der Gesamtfläche im Tenotomiespalt. Mann Whitney U-Test, *p<0,05, dargestellt werden Median, IQT, Min/Max, WT n=4, ITGA2-/- n=5. In allen Schnittpräparaten konnte zwei Wochen post OP Kollagen II positives Gewebe nachgewiesen werden. Zu diesem Zeitpunkt weisen die Sehnen der ITGA2 -/- Tiere 51

62 Ergebnisse signifikant (p= 0,016) mehr Kollagen II positives Gewebe auf (WT: 3,835 ± 2,495 % vs. ITGA2-/-: 18,302 ± 14,7474 %). Abb. 18: Kollagen II Anteil 4 Wochen post OP. Gemessen wurde der prozentuale Anteil von Kollagen II positiven Knorpel an der Gesamtfläche im Tenotomiespalt. Mann Whitney U-Test, *p<0,05, dargestellt werden Median, IQT, Min/Max, WT n=5, ITGA2-/- n=5) In der immunhistochemischen Färbung des Kollagen II positiven Gewebes der Präparate vier Wochen post OP kann der gleiche Trend dargestellt werden (siehe Abb. 18). Auch hier haben die Sehnen der ITGA2 -/- Tiere signifikant mehr Knorpel gebildet (WT: 6,356 ± 3,2329 % vs. ITGA2 -/-: 18,65 ± 10,2001 %, p=0,0317). Bei der Betrachtung der prozentualen Zunahme der Mittelwerte liegt die Verteilung folgendermaßen: Das Kollagen II positive Gewebe des ITGA2 -/- hat in den vier Wochen Präparaten um ca. 1,9 % Prozent zugenommen gegenüber den zwei Wochen Präparaten, wohingegen das Kollagen II positive Gewebe des WT in diesem Untersuchungszeitraum um 65,73 % zugenommen hat. Ob in den Präparaten des ITGA2-/- früher Knorpel gebildet worden ist, lässt sich mit der verwendeten Methode nicht darstellen. In den Präparaten eine Woche post OP zeigt keines der untersuchten Präparate Knorpelanlagen. Allerdings ist aus den 52

63 Ergebnisse Ergebnissen ersichtlich, dass insbesondere in dem frühen Zeitpunkt zwei Wochen post OP der Integrin- knockout eine gesteigerte Knorpelentwicklung gegenüber dem WT bedingt. Das Kollagen II markierte Gewebe zu diesem Zeitpunkt ist außerdem von der Fläche größer als beim WT vier Wochen post OP. Die Knorpelanlage scheint bei dem ITGA2 -/- zwei Wochen post OP von der Flächenausprägung nahezu abgeschlossen zu sein, wohingegen beim Wildtyp noch ein Flächenzuwachs in den vier Wochen post OP-Präparaten zu verzeichnen ist. Um die weiter differenzierten hypertrophen Chondrozyten spezifisch anzufärben, wurde eine Kollage X Färbung durchgeführt, wie in Abb. 19 dargestellt. 53

64 Ergebnisse Abb. 19: Kollagen X Anteil 4 (A,B) und 6 (C,D) Wochen post OP (A) Immunhistochemische Färbung von Kollagen X 4 Wochen post OP. Der ITGA2 -/- weist deutlich mehr Kollagen X auf. (B) Rein deskriptive Statistik der Kollagen X pos. und neg. Proben zu diesem Zeitpunkt. In mehr Präparaten des ITGA2 -/- befindet sich Kollagen X pos. Gewebe. (C) Immunhistochemische Färbung von Kollagen X 6 Wochen post OP. Der Anteil von Kollagen X zw. WT und ITGA2 -/- ist ähnlich. (D) Deskriptive Statistik zu diesem Zeitpunkt. Es befindet sich bei beiden Genotypen Kollagen X positives Gewebe im histolog. Schnitt. Bei dem Untersuchungszeitpunkt vier Wochen post OP ist beim WT eine von insgesamt fünf Proben mit Kollagen X anfärbbar, mit einer Fläche von 0,05 % der Gesamtfläche. Bei den Proben sechs Wochen post OP waren es vier von fünf Proben. Die durchschnittliche Kollagen X positive Fläche beträgt dann 4,9 %. Die Probengröße ist hier zu klein für eine verlässliche statistische Auswertung, aus diesem Grund 54