Einfluss von Bestrahlung und Reverse-Transkriptase-Inhibitoren auf Zelltod und Zellzyklus von Fibroblasten und Pankreastumorzellen
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- Jesko Jasper Engel
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1 Einfluss von Bestrahlung und Reverse-Transkriptase-Inhibitoren auf Zelltod und Zellzyklus von Fibroblasten und Pankreastumorzellen Hecht M. 1, Gaipl U. 1, Distel L. 1, Fietkau R. 1, Harrer T. 2, Keller U. 1 1 Universitätsklinikum Erlangen, Strahlenklinik, Erlangen, Germany 2 Universitätsklinikum Erlangen, Medizinische Klinik 3, Erlangen, Germany Poster: 11- Gefördert aus dem Elan-Fond des Universitätsklinikums Erlangen
2 Hintergrund Tumorbestrahlungen bei HIV-positiven Patienten Bei HIV-positiven Patienten ist die Inzidenz von Tumorerkrankungen erhöht. Folglich sind oft Tumorbestrahlungen bei Patienten unter HAART (Highly Active Anti- Retroviral Therapy) nötig. Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (nrti) werden häufig in der HAART eingesetzt und sind den Nukleosiden bei der humanen DNA-Replikation ähnlich. Deshalb können sie die DNA-Synthese behindern und haben möglicherweise strahlensensibilisierende Wirkung. In dieser Arbeit soll der nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitor Zidovudin (AZT=Azidothymidin) sowie die moderne Dreifachkombination aus Efavirenz (EFV nichtnukleosidischer RTI) plus Tenofovir (TDF, nrti) plus Emtricitabin (FTC, nrti) untersucht werden. Die Strahlensensibilisierung wird mittels Zelltodesanalysen bestimmt.
3 Material und Methoden: Verwendete Zellen: Primäre Fibroblasten TE und Pankreastumorzellen BxPC-3 48h nach Einsähen der Zellen: Behandlung entweder mit AZT 2µmol/l (kurz: A) oder der Kombination EFV+TDF+FTC 4µmol/l (kurz: ETF) 24h später: Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlung 48h später: Färbung mit 1) Annexin V + Propidiumjodid 2) Propidiumjodid in Gegenwart des Detergenz Triton X Durchflusszytometrische Messungen: EPICS XL-MCL der Firma Beckmann Coulter GmbH Auswertung exemplarisch an medikamentös behandelten und bestrahlten Pankreastumorzellen: Auswertung: Foreward-Sidward- Auswertung: Annexin V + Pi Auswertung: Pi + Triton Scatter (FS/SS) Tote Zellen haben mehr Seitwärtsund weniger Vorwärtsstreulicht, da kleiner und inhomogener. Sterbende Zellen binden Annexin V auf äußerer Membran. Mit Pi testet man Durchlässigkeit der Membran. Triton X permeabilisiert Membranen und Pi färbt DNA. Vom DNA-Gehalt Rückschluss auf Zellzyklusphase.
4 Ergebnisse: Annexin V - Propidiumjodid Färbung (Ein exemplarischer Versuch ist dargestellt.) Primäre Fibroblasten TE Pankreastumorzellen BxPC-3 Foreward-Sideward-Scatter Foreward-Sideward-Scatter tote Zellen tote Zellen 1 1 Annexin V - Propidiumjodid - Färbung Annexin V - Propidiumjodid - Färbung primär sekundär apoptotisch primär sekundär apoptotisch Todesrate bei EFV+TDF+FTC im Vergleich zur Kontrolle ohne und mit Bestrahlung erhöht (Todesart: primäre Nekrose) -Zelltod durch primäre Nekrose -Todesrate bei EFV+TDF+FTC und bei AZT im Vergleich zur Kontrolle ohne und mit Bestrahlung erhöht -Zelltod v.a. durch Apoptose
5 Ergebnisse: Propidiumjodid - Triton Färbung (Ein exemplarischer Versuch ist dargestellt.) Primäre Fibroblasten TE Pankreastumorzellen BxPC-3 Propidiumjodid Triton - Färbung: Zelltod Propidiumjodid - Triton - Färbung: Zelltod subg subg1 Propidiumjodid - Triton - Färbung: Zellzyklus Propidiumjodid - Triton - Färbung: Zellzyklus 12% 12% 1% 1% 8% 6% 4% G2/M-Phase S-Phase G1-Phase 8% 6% 4% G2/M-Phase S-Phase G1-Phase 2% 2% % % -Kein Effekt der Medikamente auf subg1, d.h. Anteil der Zellen mit fragmentierter DNA nicht beinflusst -Im Zellzyklus bei EFV+TDF+FTC mit Bestrahlung geringerer Anteil in G2/M-Phase im Vergleich zur bestrahlten Kontrolle -Bei EFV+TDF+FTC mit und ohne Bestrahlung mehr Zellen in subg1 -Im Zellzyklus bei EFV+TDF+FTC mit Bestrahlung geringerer Anteil in G2/M-Phase im Vergleich zur bestrahlten Kontrolle
6 Zusammenfassung und Schlussfolgerung Zelltodesanalyse Bei den Fibroblasten zeigt sich bei der Kombination EFV+TDF+FTC eine erhöhte Todesrate sowohl ohne als auch mit Bestrahlung. Bei den Pankreastumorzellen steigt bei sowohl bei AZT als auch bei EFV+TDF+FTC ohne und mit Röntgenstrahlung der Anteil an toten Zellen, was sich sowohl in der Annexin/Pi- Färbung als auch beim Nachweis fragmentierter DNA (subg1) zeigt. Die Zunahme der Todesrate durch Bestrahlung ist nach medikamentöser Behandlung geringer ausgeprägt als bei alleiniger Bestrahlung. Zellzyklusanalyse Die Dreierkombination zeigt zudem bei beiden Zelllinien Auswirkungen auf den Zellzyklus. Es befinden sich nach der Bestrahlung weniger Zellen in der G2/M-Phase. Folgerung Sowohl Zidovudin als auch die Kombination Efavirenz plus Tenofovir plus Emtricitabin können in Kombination mit Bestrahlung eine erhöhte Zelltodesrate verursachen. Bei HIV-Patienten mit dem häufigen Therapieschema Efavirenz plus Tenofovir plus Emtricitabin könnten bei Bestrahlung möglicherweise vermehrt Nebenwirkungen auftreten.
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