Analyse des Genoms des Pseudomonas-Phagen 0CTX, insbesondere der Steuerung der späten Gene

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Lothar Armbruster
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1 Analyse des Genoms des Pseudomonas-Phagen 0CTX, insbesondere der Steuerung der späten Gene Frank Wilhelm Langewische

2 Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen Verzeichnis der Abkürzungen Seite VI VIII IX 1 Einleitung Pseudomonas aeruginosa Vorkommen und Charakteristik von Pseudomonas aeruginosa Pathogenität von Pseudomonas aeruginosa im human- und veterinärmedizinischen Bereich und Bildung von Virulenzfaktoren Bakteriophagen Bedeutung und Typisierung von Bakteriophagen Der Phage < >CTX Ziele dieser Arbeit 6 2 Material Biologische Materialien Bakterienstämme Plasmide Zur Klonierung verwendete Plasmide Zur Sequenzierung verwendete ())CTX-Subklone : Abbildungen der zur Sequenzierung verwendeten Plasmide Enzyme, DNA-Marker und Loading Dye Solution Nährmedien/-komponenten Kommerzielle Kits Chemische Substanzen Reagenzien 16

2.2 Der Phage < >CTX 5 1.3 Ziele dieser Arbeit 6 2 Material 7 2.1 Biologische Materialien 7 2.1.1 Bakterienstämme 7 2.1.2 Plasmide 7 2.1.2.1 Zur Klonierung verwendete Plasmide 7 2.1.2.2 Zur Sequenzierung verwendete ())CTX-Subklone : 8 2.

3 2.3 Geräte und Verbrauchsmaterial Geräte Verbrauchsmaterial Computerprogramme 20 3 Methoden Allgemeine Methoden Herstellung von LB-Medium und LB-Medium mit Ampicillin-/Carbenicillin-Zusatz Herstellung von LB-Agarplatten und LB-Ampicillin-/ Carbenicillin-Agarplatten Herstellung von TSB-Medium und TSB-Ampicillin-Medium Herstellung von TSA-Platten und TSA-Ampicillin-Platten Herstellung von NZY+Medium Herstellung von A-Medium und A-Medium mit Ampicillin-/ Carbenicillin-Zusatz Bestimmung des DNA-Gehaltes Molekularbiologische Methoden Phagen-DNA-Präparation Mikroquick-Plasmid-Präparation Plasmid-Präparation mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit" Restriktionsverdau Amplifikation von DNA-Fragmenten mit dem Expand High Fidelity PCR System" Agarosegel-Elektrophorese Präparative Agarosegel-Elektrophorese zur DNA-Gewinnung Extraktion der DNA mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit" Ligation von linearisierter DNA mit dem Rapid DNA Ligation Kit" Aufreinigung des Ligationsansatzes mit dem High Pure PCR Product Purification Kit" 32

1.5 Herstellung von NZY+Medium 22 3.1.6 Herstellung von A-Medium und A-Medium mit Ampicillin-/ Carbenicillin-Zusatz 22 3.1.7 Bestimmung des DNA-Gehaltes 22 3.2 Molekularbiologische Methoden 23 3.2.1 Phagen-DNA-Präparation 23 3.

4 Herstellung kompetenter E. coli HBIOI-Zellen mittels CaCl 2 -Methode und Plasmidtransformation Herstellung elektrokompetenter E. coli XL 1-Blue Zellen Transformation elektrokompetenter E. co/; XLl-Blue Zellen mittels Elektroporation und anschließende Kontrolle neu erstellter Klone Herstellung elektrokompetenter P. aeruginosa GuA18D Zellen : Transformation elektrokompetenter P. aeruginosa GuA 18D Zellen mittels Elektroporation Transformation von superkompetenten E. coli XLl-Blue Zellen Erstellung von Glycerolsteps plasmidtragender Bakterien Automatisierte DNA-Sequenzierung Sequenzierung mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit" Sequenzierung mit dem BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit" Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Einlesen der Sequenz Auswahl der Sequehzierprimer Durchführung des ß-Galactosidase-Assays 42 4 Ergebnisse Sequenzierung des <j>ctx-genoms Sequenzierung der <j>ctx-subklone, Korrektur der gewonnenen Sequenzdaten und Gesamtgenomgröße Probleme bei der Sequenzierung G+C-Gehalt und Leserahmen des ( >CTX-Genoms und datenbankgestützte Homologiesuche Allgemeine Auswertung Homologien zu Capsidsynthese- und DNA-Verpackungsgenen anderer Phagen Homologien zu Schwanzgenen anderer Phagen Homologien zu Lysisgenen anderer Phagen Homologien zu frühen Genen anderer Phagen 57 III

aeruginosa GuA 18D Zellen mittels Elektroporation 36 3.2.16 Transformation von superkompetenten E. coli XLl-Blue Zellen 36 3.2.17 Erstellung von Glycerolsteps plasmidtragender Bakterien 36 3.2.18 Automatisierte DNA-Sequenzierung 37 3.

5 4.2.6 Vergleiche von cos der Phagen (j)ctx, P2, P4 und Steuerung der späten Gene von (])CTX Transkriptionsaktivatorprotein der späten Promotoren Analyse putativer später Promotoren von < >CTX und Klonierung der putativen Promotoren Po und Pp in das Reporterplasmid pqf Nachweis der Promotoraktivität von Po und P P durch den ß-Galactosidase-Assay Terminatorstrukturen von <j>ctx 66 5 Diskussion Sequenzierung des ( )CTX-Genoms G+C-Gehalt und Leserahmen des <j)ctx-genoms und datenbankgestützte Homologiesuche Allgemeine Auswertung Homologien zu Capsidsynthese- und DNA-Verpackungsgenen anderer Phagen Homologien zu Schwanzgenen anderer Phagen Homologien zu Lysisgenen anderer Phagen Homologien zu frühen Genen anderer Phagen Vergleiche von cos der Phagen <j>ctx, P2, P4 und A+T-reiche Regionen und Codonadaptation von i >CTX-ORFs an P. aeruginosa Steuerung der späten Gene von <)>CTX und experimentelle Analyse der Aktivität der putativen späten Promotoren P o und Pp : Terminatorstrukturen von <(>CTX Schlußfolgerungen aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit 81 Zusammenfassung 83 Summary 85 IV

2 G+C-Gehalt und Leserahmen des <j)ctx-genoms und datenbankgestützte Homologiesuche 71 5.2.1 Allgemeine Auswertung 71 5.2.2 Homologien zu Capsidsynthese- und DNA-Verpackungsgenen anderer Phagen 75 5.

6 8 Literatur 87 9 Anhang Nukleotidsequenz des Phagen (jictx mit Übersetzung in die 6 Leserahmen und Kennzeichnung der Sequenzierprimersequenzen Verzeichnis der Homologien zu Proteinen anderer Phagen und zu lytischen Enzymen grampositiver Bakterien PCR-Primer zur Amplifikation der putativen späten 4>CTX-Promotorsequenzen Po und/v.' Primer zur Sequenzierung der in pqf50 einklonierten putativen späten Promotorsequenzen Po und Pp 197

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