Eukaryontische DNA-Bindedomänen

Transkript

1 1. Viele eukaryotische (und auch prokaryotische) Transkriptionsfaktoren besitzen eine DNA-bindende Domäne, die an eine ganz bestimmte DNA- Sequenz binden kann. Aufgrund von Ähnlichkeiten in der Struktur der DNAbindenden Domäne können diese Transkriptionsfaktoren zu Familien gruppiert werden. Nennen Sie vier verschiedene Familien. Übung 11

2 Eukaryontische DNA-Bindedomänen Regulation II Homöodomänen Proteine helix-turn-helix Motif; kontrollieren viele grundlegende Entwicklungsprogramme Leucin Zipper Motif zwei lange α-helices bilden eine pinzettenartige Struktur. Dimerisierung über Leucin Zipper Zink bindende Domänen Zink Finger (TFIIIA) Zink Cluster (Gal4) Zinc koordiniert durch zwei His in einer α-helix und zwei Cys in einem β-faltblatt Helix-Loop-Helix Proteine zwei α-helices durch flexible Schleife getrennt; basische HLH Proteine Aktivierungsdomänen sind im Gegensatz zu DNA-Bindedomänen keine genau definierten Strukturen ( klebrige Oberflächen )

3 Übung Welche verschiedenen Klassen von Transkriptionsfaktoren sind bei der Transkription in Eukaryoten beteiligt? generelle Transkriptionsfaktoren: TFIID (TBP) TFIIA TFIIB TFIIF TFIIE TFIIH spezifische Transkriptionsfaktoren: z.b. Gal4

4 Übung Was ist ein Enhancer? Was ist ein Silencer? Enhancer (engl. enhance "verstärken" dt. Transkriptionsverstärker): Abschnitte mit charakteristischer Basenabfolge in der DNA, die (wie auch die Silencer), zu den cis-elementen gehören. Sie beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotor und verstärken somit die Transkriptionsaktivität eines Gens. Entscheidend für diese Transkriptionsverstärkung ist die räumliche Orientierung des Enhancers zum Promoter (Enhancer-Promoter-Wechselwirkung). Somit kann der Enhancer viele tausend Kilobasen vor (upstream) oder hinter (downstream) dem Promoter entfernt liegen und trotzdem durch die dreidimensionale Supercoil-Struktur der DNA in die räumliche Nähe der Promotersequenz gebracht werden. Silencer: DNA-Sequenz distal zum Promotor vor oder nach dem eigentlichen Gen. Sie gehören zu den cis-elementen. Sie setzen, im Zusammenspiel mit Transkriptionsfaktoren, die Transkriptionsaktivität eines Gens herab. Ihr Wirkmechanismus entspricht dem der Enhancer, jedoch mit entgegengesetztem Ergebnis.

5 4. Beschreiben Sie die verschiedenen molekularen Mechanismen, wie Transkriptionsaktivatoren die Transkription eines Zielgens in eukaryotischen Zellen stimulieren. Übung Rekrutierung der RNAP II durch direkte Interaktion mit Transkriptionsfaktoren

6 Funktion des Gal4 Aktivatorproteins 1. Rekrutierung der RNAP II durch direkte Interaktion mit Transkriptionsfaktoren Regulation II - Gal4 bindet an das TBP (TATA binding protein) und erleichtert dadurch die Anlagerung an den generellen Transkriptionsfaktor TFIID und die Rekrutierung der RNAP II - Ebenfalls Interaktion mit dem Mediator Komplex, der als Coaktivator fungiert

7 4. Beschreiben Sie die verschiedenen molekularen Mechanismen, wie Transkriptionsaktivatoren die Transkription eines Zielgens in eukaryotischen Zellen stimulieren. Übung Rekrutierung der RNAP II durch direkte Interaktion mit Transkriptionsfaktoren 2. Interaktion mit Modifikatoren der Chromatinstruktur: Chromatin Remodellierungs Komplex SWI-SNF

8 Funktion des Gal4 Aktivatorproteins 1. Rekrutierung der RNAP II durch direkte Interaktion mit Transkriptionsfaktoren 2. Interaktion mit Modifikatoren der Chromatinstruktur: Chromatin Remodellierungs Komplex SWI-SNF - durch Remodellierungen der Chromatinstruktur werden regulatorische Sequenzen (z.b. Promotor) zugänglich Regulation II blockiert zugänglich

9 Regulation II - die Chromatinstruktur kann auch durch Modifizierung der Histone verändet werden - Acetylierung (Auflockerung des Chromatins) bzw. Deacetylierung (Verdichtung des Chromatins) der N-terminalen Enden der Histonproteine: Histon-Code HATs: Histon Acetyl Transferasen

10 5. Beschreiben Sie die verschiedenen molekularen Mechanismen, wie Transkriptionsrepressoren die Transkription eines Zielgens in eukaryotischen Zellen inhibieren. Übung 11

11 Repressoren Regulation II - der gängigste Mechanismus in Bakterien, die Bindung eines Repressors im Bereich des Promotors und die resultierende Inhibition der Transkriptionsinitiation, ist in Eukaryonten nicht präsent! stattdessen: Kompetition, Inhibition, direkte / indirekte Repression

12 Übung Wie wirken sich die folgenden Mutationen auf die Transkription von GAL1 in Gegenwart von Galactose aus? a. Deletion einer Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. b. Deletion aller vier Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. c. Deletion der Mig1-Bindestelle stromaufwärts von GAL1. d. Deletion der Gal4 aktivierenden Domäne. e. Deletion des GAL80 Gens. f. Deletion des GAL1 Promotors. g. Deletion des GAL3 Gens.

13 Regulation II Gal4 als Beispiel eines eukaryontischen Transkriptionsaktivators - 17 bp lange Gal4 Bindestelle wird von einem Gal4 Dimer besetzt - 2 bzw. 4 dieser Gal4 Bindestellen vor den Genen der Enzyme - 2 bzw. 4 dieser Gal4 Bindestellen vor den Genen der Enzyme

14 Übung Wie wirken sich die folgenden Mutationen auf die Transkription von GAL1 in Gegenwart von Galactose aus? a. Deletion einer Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. Transkriptionsrate geringfügig schwächer b. Deletion aller vier Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. keine Transkription von Gal1 c. Deletion der Mig1-Bindestelle stromaufwärts von GAL1. d. Deletion der Gal4 aktivierenden Domäne. e. Deletion des GAL80 Gens. f. Deletion des GAL1 Promotors. g. Deletion des GAL3 Gens.

15 Mig1: Reperssor, aktiv nur in Gegenwart von Glukose; rekrutiert Tup1 (Histon Deacetyladse) Übung 11

16 Übung Wie wirken sich die folgenden Mutationen auf die Transkription von GAL1 in Gegenwart von Galactose aus? a. Deletion einer Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. Transkriptionsrate geringfügig schwächer b. Deletion aller vier Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. keine Transkription von Gal1 c. Deletion der Mig1-Bindestelle stromaufwärts von GAL1. normale Transkription von Gal1 d. Deletion der Gal4 aktivierenden Domäne. e. Deletion des GAL80 Gens. f. Deletion des GAL1 Promotors. g. Deletion des GAL3 Gens.

17 Regulation II Regulation der Gal4 Aktivität - in GAL80 Mutanten sind die katabolen Gal-Gene konstitutiv aktiv - in GAL3 Mutanten sind die katabolen Gal-Gene auch in Gegenwart von Galaktose inaktiv - Gal80 blockiert die Gal4 Aktivierungsdomäne - Gal3 fungiert als Sensor: macht nach Galaktose und ATP Bindung eine Konformationsänderung durch und bindet damit Gal80 Gal4-Aktivierungsdomäne ist frei

18 Übung Wie wirken sich die folgenden Mutationen auf die Transkription von GAL1 in Gegenwart von Galactose aus? a. Deletion einer Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. Transkriptionsrate geringfügig schwächer b. Deletion aller vier Gal4 Bindestelle im GAL1-UAS Element. keine Transkription von Gal1 c. Deletion der Mig1-Bindestelle stromaufwärts von GAL1. normale Transkription von Gal1 d. Deletion der Gal4 aktivierenden Domäne. keine Transkription von Gal1 e. Deletion des GAL80 Gens. Transkription von Gal1 f. Deletion des GAL1 Promotors. keine Transkription von Gal1 g. Deletion des GAL3 Gens. keine Transkription von Gal1