Isolierung von Glyoxysomen

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1 1 Isolierung von Glyoxysomen 1. Glyoxysomen: Aufbau Alle eukaryontischen Zellen enthalten Peroxysomen. Das sind kleine, mit nur einer Membran gegenüber dem Cytoplasma abgegrenzte Vesikel mit einem Durchmesser von ca. 0,2-1,5 µm. Die Membranen besitzen keine Invaginationen und sind stets ohne Ribosomenbesatz. Peroxysomen enthalten Enzyme die die bei verschiedenen Stoffwechselvorgängen entstehenden freien Radikale unschädlich machen. Glyoxysomen sind spezialisierte Peroxysomen, die nur in Pflanzenzellen -hier vor allem in keimenden Samen- vorkommen. In ihnen sind Enzyme der Fettsäureoxidation und des Glyoxylatzyklus lokalisiert. Mit Beginn der Keimung entstehen die Glyoxysomen in großer Zahl in den fettspeichernden Zellen des Endosperms bzw. der Kotyledonen, vermutlich durch Abschnürung vom Endoplasmatischen Retikulum. Die Enzyme werden erst später in die Vesikel eingelagert Glyoxysomen: Funktion Bei den Pflanzensamen dienen vor allem Fette als Energiespeicher. Mit Beginn der Keimung besteht aber auch ein Bedarf an Kohlenhydraten (z.b. zur Synthese von Zellulose). Da der Keimling in den ersten Tagen noch nicht zur Photosynthese in der Lage ist, muß der gesamte Energie- und Baustoffbedarf aus dem gespeicherten Material gedeckt werden. Die Glyoxysomen enthalten hierzu einen Teil der Enzyme, die zum Fettsäureabbau und zur Gluconeogenese notwendig sind. Der Reaktionszyklus der zur Überführung eines C2-Körpers (Acetyl-CoA, dem Endprodukt des Fettsäureabbaus) in einen C4-Körper (Succinat) führt, wird als Glyoxylat- oder Krebs-Kornberg-Zyklus bezeichnet. Der Glyoxylatzyklus kann auch von Bakterien durchgeführt werden, hier befinden sich die entsprechenden Enzyme jedoch in/an der Cytoplasmamembran und im Cytoplasma. Der Glyoxylatzyklus in Pflanzenzellen ist auf drei intrazelluläre Kompartimente aufgeteilt, zwischen denen ein reger Stoffaustausch herrscht (Abb. 1). Von den Enzymen, die sowohl am Zitronensäure- als auch am Glyoxylatzyklus beteiligt sind, gibt es jeweils zwei Isoenzyme. Nachdem die Fettsäuren in den Glyoxysomen über die β-oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut wurden, wird Acetyl-CoA mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat kondensiert. Es erfolgt eine Umlagerung über cis-aconitat zu Isocitrat. Isocitrat wird von der Isocitrat-Lyase, einem der beiden Leitenzyme der Glyoxysomen, zu Succinat und Glyoxylat gespalten. Succinat wird in die Mitochondrien transportiert und über die Reaktionen des Zitronensäure- oder Krebs- Zyklus zu Oxalacetat umgesetzt. Durch eine Transaminierung entsteht Aspartat, das wieder in die Glyoxysomen gelangt. Das Aspartat wird hier wieder zu Oxalacetat desaminiert und steht für

2 2 eine erneute Kondensation mit Acetyl-CoA zur Verfügung. Aus dem bei der Spaltung von Isocitrat entstandenen Glyoxylat entsteht durch Malat-Synthase Malat. Malat wird ins Cytoplasma transportiert und steht hier zur Synthese von Glucose (Gluconeogenese) zur Verfügung. Die Malat-Synthase ist das zweite Leitenzym der Glyoxysomen. Als Summe der Reaktionen des Glyoxylatzyklus ergibt sich: 2 Acetyl-CoA + NAD + + 2H 2 O Succinat + 2 CoA + NADH + H + Die Reaktionen des Glyoxylatzyklus sind in Abb.2 übersichtlich dargestellt. Abb. 1. Aufteilung der Reaktionen des Glyoxylatzyklus in verschiedene Kompartimente.

3 3 Abb.2. Reaktionen des Glyoxylatzyklus Der Begriff Leitenzym Die eukaryontischen Zellen bestehen aus verschiedenen Kompartimenten wie Cytosol, Zellkern, Mitochondrien etc. Bei Pflanzenzellen kommen noch verschiedene andere Organellen wie z.b. Plastiden und Glyoxysomen vor. In diesen Organellen sind spezifische Stoffwechselreaktionen mit den dazugehörigen Enzymen lokalisiert. Man bezeichnet das dort vorherrschende und charakteristische, nicht in anderen Organellen vorkommende Enzym als Leitenzym dieser Struktur. Dessen spezifische Aktivität hilft bei der differentiellen Zentrifugation, aber auch bei der Gradientenzentrifugation, Zellfraktionen zu identifizieren.

4 4 2. Isolierung von Glyoxysomen Die Isolierung der Glyoxysomen erfolgt durch differentielle Zentrifugation und einer anschließenden Auftrennung der verschiedenen Zellfraktionen in einem Saccharosedichtegradienten. Als Ausgangsmaterial dienen 20 g vorgekeimte (3 Tage bei 26 C) Sonnenblumenkerne. Alle Präparationsschritte sollten auf Eis und mit vorgekühlten Puffern durchgeführt werden, um den durch Proteasen bedingten Proteinverlust zu minimieren. Das Endospermgewebe wird unter Zusatz von 2 Volumen (1 Volumen = g eingesetztes Gewebe in ml) Puffer 1 mit einem Zwiebelhacker fein zerkleinert und anschließend in einem Mörser weiter zerrieben. Der resultierende Brei wird durch 4 Lagen Verbandsmull filtriert, und der Filterkuchen vorsichtig ausgepreßt. Das Filtrat, welches die Glyoxysomen enthält, wird nach folgendem Schema weiter aufgearbeitet: Filtrat Zentrifugation Rotor SS rpm (270 g), 10 min Überstand 1 (Ü1) Pellet 1 (P1) Zentrifugation Rotor SS rpm (10000 g), 30 min Überstand 2 (Ü2) Pellet 2 (P2) I in wenig Puffer 1 (2 ml) aufnehmen I mg Protein auf einen Saccharosegradienten auftragen I Zentrifugation Rotor SW rpm ( g), 2 h I Gradient am Fraktionssammler absaugen und fraktioniert auffangen (F1 - F4) Puffer1: 0,5 M Saccharaose Saccharosegradient: 60 % (w/w) Saccharose 0,15 M Tris/HCL, ph 7,5 57 % (w/w) Saccharose 10 mm KCl 50 % (w/w) Saccharose alle mit 1 mm EDTA 1 mm MgCl 2 44 % (w/w) Saccharose 1 mm EDTA 33 % (w/w) Saccharose 10 mm Dithiothreitol 25 % (w/w) Saccharose Von allen Proben (Filtrat, Überstände, Pellets und Gradientenfraktionen) werden Proteinbestimmungen sowie Enzymtests gemacht um die Aufreinigung der Glyoxysomen zu verfolgen.

5 5 3. Proteinbestimmung nach Bradford Bei der Proteinbestimmung nach Bradford handelt es sich um eine kolorimetrische Proteinbestimmung. Die Methode beruht auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 an Proteine. Hierbei kommt es zu einer Verschiebung des Extinktionsmaximums des Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm. Da der Proteintest schnelle Ergebnisse liefert, auf Saccharose und die meisten Salze nicht anspricht und nur durch Detergentien in höheren Konzentrationen beeinflußt wird, kommt er häufig zur Anwendung. Testansatz: 790 µl Wasser 10 µl Proteinlösung (max. 10 mg Protein) 200 µl Bradford-Reagenz 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen Extinktion bei 595 nm im Photometer gegen Blindwert messen Die Proteinkonzentration wird anhand einer Eichgeraden berechnet und in die Aufreinigungstabelle eingetragen. Es gilt (eine evtl. Verdünnung der Probe ist zu berücksichtigen!): Extinktion 595nm / Faktor aus Eichgerade = µg Protein / 10µl Lösung 4. Bestimmung der Enzymkinetik Es wird die katalytische Aktivität der Isocitrat-Lyase, einem der beiden Leitenzyme der Glyoxysomen, bestimmt. Das bei dieser Reaktion entstehende Glyoxylat reagiert sofort mit Phenylhydrazin zu Glyoxylat- Phenylhydrazon weiter. Die Entstehung dieser Verbindung kann durch Messung der Extinktion bei 324 nm verfolgt werden.

6 Enzymtest Ansatz für Enzymtest: 400 µl 0,5 M Kalium-Phosphat-Puffer, ph 6, µl 150 mm MgCl µl 100 mm Phenylhydrazin 100 µl 60 mm Cystein 2090 µl entmineralisiertes Wasser 200 µl Protein-Probe (evtl. verdünnen) Zum Starten der Reaktion: 10 µl 0,5 M Isocitrat Es wird die Extinktionszunahme bei 324 nm (ΔE 324 ) für 3-4 min gemessen. Der Reinheitsgrad eines Enzyms wird durch die spezifische Aktivität beschrieben. Sie ist als Verhältnis der katalytischen Aktivität zum Proteingehalt der Probe definiert: (1) spez. Aktivität = katalytische Aktivität (Enzymeinheiten) Protein (mg) Ein Maß für die katalytische Aktivität ist die Änderung der Extinktion (s.o.). Die Extinktions-änderung ist proportional der Konzentrationsänderung der untersuchten Verbindung. Dieser Zusammenhang wird durch das Lambert-Beer sche Gesetz (2) beschrieben: ε: molarer Extinktionskoeffizient (2) ΔE 324 = ε Δc d Δc: Konzentrationsänderung der untersuchten Substanz d: Schichtdicke der Meßküvette Die katalytische Aktivität wird in Enzymeinheiten (Units) U angegeben. Eine Enzymeinheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, die pro Minute 1 µmol Substrat umsetzt. (Die abgeleitete SI-Einheit ist das Katal [kat]. Für die Umrechnung gilt: 1 U = 16,67 nkat). (3) Enzymeinheiten (U) = Substratumsatz (Δc) Zeit (min)

7 7 Der Substratumsatz wird durch Messen der Extinktionszunahme bei 324 nm erfaßt. Durch Einsetzen von Gleichung (2) in (3) erhält man (4) Enzymeinheiten (U) = ΔE 324 ε d min Um die spezifische Aktivität zu bestimmen werden die Enzymeinheiten in Beziehung zum Proteingehalt gesetzt, d.h. Gleichung (4) wird in (1) eingesetzt. Da ε, d und die Minute feste Größen sind, werden sie zu einer Konstanten K zusammengefaßt. Mit Gleichung (5) kann die spezifische Aktivität aus den experimentell ermittelten Daten bestimmt werden: ΔE 324 ΔE 324 (5) spez. Aktivität = = K ε d min mg Protein mg Protein K = 1, Aufreinigungstabelle: Probe Volumen ml Protein mg/ml spezifische Aktivität Gesamtprotein Gesamt- Aktivität Filtrat Ü1 P1 Ü2 P2 F1 F2 F3

8 8 Schema Stufengradient: 3 und 5 stufiger Gradient: Beispiele für den Proteingehaltsverlauf bei Stufengradienten unter verschiedenen Bedingungen: Auftrag: 1000µl Probe (ca. 50 mg Protein): Auftrag: 500 µl Probe (ca. 25 mg Protein):