Zusammenfassung Einleitung 3

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Laura Maier
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1 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 1. Einleitung Vorkommen und Bedeutung nichtsegmentierter Negativstrang Viren Persistierende Infektionen Humanmedizinische Bedeutung Untersuchungen zum Mechanismus persistierender Virusinfektionen in der Zellkultur Aufbau nichtsegmentierter Negativstrang Viren Genomorganisation Virusvermehrung in infizierten Zellen Virusknospung und Maturation Regulation der Transkription und Replikation nichtsegmentierter Negativstrang Viren Funktionen der Proteine L, NS, N und M bei der Transkription und Replikation des VSV Regulation der Polymerasefunktionen des VSV durch Phosphorylierung Paramyxoviren Das L-Protein der nichtsegmentierten Negativstrang Viren Vesikular Stomatitis Virus Paramyxoviren Ausgangssituation der vorliegenden Arbeit 22 Problemstellung Material und Methoden Material Lösungen Methoden Kulturinfektionsdosistest (KID-Test) Virusvermehrung im Hühnerei Virusreinigung Arbeiten mit Standard-Zellinien 37

2 Kulturbedingungen Zellinfektion Zellaufschluß Arbeiten mit Hybridomzellen Zellfusion Kulturbedingungen ,5.3 Subklonierung ,6. Synthetische Peptide Herstellung der synthetischen Peptide 39 2.,3.,6.2 Kopplung synthetischer Peptide an Trägerproteine Immunisierung mit synthetischen Peptiden 40 2.,3.,7. Reinigung von monoklonalen Anti-L Antikörpern aus Hybridomzell-Überständen 40 2.,3.,7.1. Amnions u 1 f at f ä 1 lung 40 2., Affinitätschromatographie an Protein A- Sepharose 41 2.,3..8. Bestimmung der Proteinkonzentration 41 2, Slotblot-Analyse von Proteinen 42 2., TCA-Fällung von Proteinen Gelelektrophoretische Methoden 42 2,.3,,11. 1 Analytische SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 42 2,.3, Färbung mit Coomassie Brilliant Blue 43 2,.3, S iiberfärbung ,, Präparative SDS-PAGE , Elektrophoretische Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen Elektrotransfer von Proteinen auf Nitrozellulosemembranen Immunologische Methoden Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) Bestimmung der Immunglobulin-Klassen Western Blot Analyse Indirekte Immunfluoreszenz Immungold-Elektronenmikroskopie Isolierung von Nukleokapsiden aus gereinigten Sendai Viren Isolierung von Nukleokapsiden bei geringer Ionenstärke 47

3 Präparation viraler Nukleokapside nach Marx et al. (1974) Nukleokapside für die Immungold-Elektronenmikroskopie Seichromatographie Ionenaustauschchromatographie Vorbereitung von Phosphozellulose Pll Chromatographie an Phosphozellulose unter nicht-denaturierenden Bedingungen Chromatographie in Gegenwart von 8M Harnstoffs Kationenaustauscher Chromatographie in Gegenwart von 8M Harnstoffs Anionenaustauscher Affinitätschromatographie an immobilisierten monoklonalen Anti-L Antikörpern Bromcyan-aktivierte Sepharose als stationäre Phase Protein A-Sepharose als Matrix Isolierung des L-Proteins durch Chromatographie an Hydroxylapatit Renaturierung des L-Proteins Optimierung der Methode nach Hager und Burgess (1980) Renaturierung nach Stewart et al. (1974) Optimiertes Standard-Verfahren zur Renaturierung des SDS-solubilisierten L-Proteins In vitro Kinase-Assay Permeabilisierte Sendai Viren Renaturierungsansätze Autoradiographie Computeranalysen Sicherheitsmaßnahmen 57 J Ergebnisse Das L-Protein des Sendai Virus als Antigen zur Gewinnung spezifischer Antikörper Synthetische Peptide als Antigene zur Gewinnung L-spezifischer Antikörper Antiseren gegen synthetische L-Peptide 64

4 Monoklonale Antikörper gegen synthetische L-Peptide Herstellung und Charakterisierung der Hybridomzellinien Nachweis des SDS-denaturierten L-Proteins Nachweis der Verteilung des L-Proteins auf Nukleokapsiden des Sendai Virus Ansätze zur Isolierung des nativen L-Proteins Isolierte Sendai Viren als Ausgangsmaterial Nukleokapside als Ausgangsmaterial für die Isolierung des L-Proteins Isolierung viraler Nukleokapside bei niedriger Ionenstärke Fraktionierung der Virusproteine bei hoher Ionenstärke Isolierung des L-Proteins unter denaturierenden Bedingungen Ionenaustauschchromatographie SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Affinitätschromatographie Chromatographie SDS-dissoziierter Virusproteine an Hydroxylapatit Funktionelle Charakterisierung des L-Proteins Die Kinase-Aktivität des Sendai Virus Etablierung eines Assays zur Kontrolle der Renaturierung des gereinigten L-Proteins Das L-Protein des Sendai Virus als spezifische Kinase Zwischenzusammenfassung Charakterisierung des L-Proteins in akut und persistent infizierten Zellen Western Blot Analyse Verteilung der viralen Nukleokapside in akut infizierten Zellen Verteilung der viralen Nukleokapside in persistent infizierten Zellen

5 4. Diskussion Das L-Protein des Sendai Virus: die experimentelle Ausgangsposition Synthetische Peptide als Antigene zur Gewinnung spezifischer Antikörper Lokalisierung des L-Proteins auf den Transkriptionskomplexen des Sendai Virus Isolierung des L-Proteins Renaturierung der L-Protein-Fraktion Die Kinase-Aktivität des Sendai Virus kann dem viralen L-Protein zugeordnet werden Das L-Protein des Sendai Virus in akut und persistent infizierten Zellen Ausblick Literaturverzeichnis 144 Abkürzungen 162 Danksagung Lebenslauf

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