Elektrophorese. Herbstsemester ETH Zurich Dr. Thomas Schmid Dr. Martin Badertscher,

Transkript

1 Elektrophorese 1

2 Elektrophorese Allgemein: Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld Analytische Chemie: Trennung von Ionen im elektrischen Feld (Elektrophoretische Trenntechniken zählen im Allgemeinen nicht zur Chromatographie) 2

3 Chromatographie-Check Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte vorhanden bzw. erfüllt sein: Trenntechnik Zwei nicht mischbare Phasen Eine mobile und eine stationäre Phase Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen 3

4 Übersicht Elektrophorese: Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) Kapillarelektrophorese (CE) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) 4

5 Gel-Elektrophorese 5

6 Gel-Elektrophorese Gel-Elektrophorese: Genetischer Fingerabdruck : 6

7 Agarose-Gelelektrophorese Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Standard Probe Probenauftragung Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung im elektrischen Feld Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung Kleine Moleküle wandern schneller als grosse Detektion: chemische Anfärbemethoden (z.b. Fluoreszenz) Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse + Probe: DNA-Fragment mit 522 Basenpaaren (bp) z.b. Auftrennung von DNA-Fragmenten (z.b. Genetischer Fingerabdruck) 7

8 Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) Z.B.: DNA fingerprinting Trennung nach Ladung und Grösse Grösse: hydrodynamischer Durchmesser Proteine werden also nach Ladung, Molekulargewicht und Faltung getrennt Bei Proteinen wird häufig die SDS-PAGE angewandt 8

9 SDS-PAGE SDS = sodium dodecyl sulfate Natriumdodecylsulfat Natriumlaurylsulfat C 12 H 25 NaO 4 S Tensid, Detergent = Herabsetzen der Grenzflächenspannung zwischen zwei Phasen z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar SDS bildet Mizellen SDS denaturiert Proteine SDS bildet negativ geladene Komplexe mit Proteinen 9

10 SDS-PAGE Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen Faltung beeinflusst nicht die Trennung Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle Trennung von Proteinen nur aufgrund des Molekulargewichts 10

11 SDS-PAGE Trennung von negativ geladenen Komplexen von SDS mit denaturierten, entfalteten Proteinen Faltung beeinflusst nicht die Trennung Zahl der SDS-Moleküle pro Protein hängt nur vom Molekulargewicht ab, Eigenladung der Proteine spielt keine Rolle SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8) gemäss ihres Molekulargewichts. Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse als Molekulargewichtsstandard (14 97 kda) Trennung von Proteinen nur aufgrund des Molekulargewichts 11

12 Übersicht Elektrophorese: Gel-Elektrophorese Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) Kapillarelektrophorese (CE) Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) 12

13 Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis = CE) Migration eines Ions im elektrischen Feld E Analyten müssen geladen sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine Chromatographie! Adenosine Triphosphate Neuraminsäuren 13

14 CE: Theoretische Grundlagen Elektrophoretische Mobilität µ EP eines Ions im elektrischen Feld E µ EP = v E = Geschwindigkeit eines Ions Elektrische Feldstärke = e 6π 1 η z r e... Elementarladung η... Viskosität der Pufferlösung z... Ladung des Ions r... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions Konstante Pufferlösung Ion (Analyt) Trennung aufgrund von Ladung und Grösse der Ionen 14

15 CE: Theoretische Grundlagen Migration der Ionen im elektrischen Feld µ EP = v E = Geschwindigkeit eines Ions Elektrische Feldstärke = e 6π 1 η z r Probeneinlass Detektor Anionen wandern in Richtung Anode und Kationen in Richtung Kathode Man würde in diesem Fall nur die Kationen detektieren + Anode Analyt- Analyt- Analyt- Analyt- Analyt+ Analyt+ Analyt+ Kathode Nach dem Probeneinlass wird Spannung angelegt (bis zu V) Analytionen trennen sich nach Ladung (und Grösse) 15

16 CE: Theoretische Grundlagen Elektroosmotischer Fluss (EOF) bei Quartzkapillaren Quarzkapillare (SiO 2 ) EOF + Analyt- Analyt+ Anode Quarzkapillare (SiO 2 ) Kathode Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF). 16

17 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Trennung von Kationen und Anionen Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare Kationen Neutrale Moleküle (ungetrennt) Anionen Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht 17

18 Aufbau eines CE Systems: A) B) C) 2 x glass vials Fused silica capillaries High voltage power supply (with platin electrodes) A C D) Detector B D) B 18

19 CE: Beispiel Detektion: In der Regel UV Detektoren Trennung von Metaboliten: 75cm Kapillare Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping Elektropherogram Kopplung an Massen- Spektrometrie ist schwierig Trennung: Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer 19

20 CE: Beispiel Detektion: In der Regel UV Detektoren Kopplung an MassenSpektrometrie ist schwierig 20