Versuchsprotokoll: Aminosäure- und Proteinbestimmung

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Hansi Hofmeister
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1 Versuchsprotokoll: Aminosäure- und Proteinbestimmung a) Proteinbestimmung mit Biuret-Reagenz 1.1. Einleitung Das Ziel des Versuchs ist es nach Aufstellen einer Eichgerade mit gegeben Konzentrationen, die Konzentration zweier unbekannter aseinlösungen zu bestimmen. Dazu bedienen wir uns im Versuchsteil a) der Biuret-Reagenz. Diese Reagenz färbt sich proportional zu der Proteinkonzentration der Lösung Material und Methode Die in diesem Versuchsteil zu benutzenden Materialien sind im Skript auf Seite 2 unter Reagenzien angegeben. Ein Photometer setzt die Anfangsintensität (I 0 ) des Lichts mit der Intenstiät (I), die nach Durchleuchtung der Probe nicht absorbiert wird, in Verhältnis: I / I 0 wird als die Transmission bezeichnet. Um nun eine lineare Funktion zu erhalten, nimmt man den log vom Kehrwert der Transmission: log 1 / T. Dies entspricht der Extinktion. Steigt die Extinktion, so ist auch die Konzentration der Lösung höher. Somit ist die Extinktion ein Maß für die Absorption. Nach dem Lambert-Beer schen Gesetz ist die Extinktion E = c x d x ε (c = Konzentration, d = die zu durchquerende Schichtdicke, ε = Extinktionskoeffizient) Da d und ε gleich bleiben, erhöht sich die Extinktion proportional zur Konzentration der Lösung Versuchdurchführung Siehe Skript! 1.4. Versuchsergebnisse B1 B2 B3 B4 B5 B6 Probe I Probe II asein- Konzentration ,74 17,13 in g/l Extinktion 0 0,085 0,205 0,395 0,59 0,785 0,38 0,675 Die Funktion der Eichgeraden ist: y = 0,0394 x. 1

2 Setzt man nun die gemessenen Extinktionen der Probenlösungen ein, berechnet man damit die Konzentrationen. (obige Tabelle) Extinktion Extinktion mit Biuret-Reagenz y = 0,0394x 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, Konzentration in g / l 1.5. Auswertung Die Färbungen der verschiedenen Lösungen kommen durch die Komplexbildung von den in der Biuret-Lösung vorhandenen u 2+ - Ionen und den Proteinen zustande. Ist die Konzentration der Proteinlösung höher bilden sich mehr Komplexe und in Folge dessen steigt auch die Extinktion. Peptidkette 1 N R N R N 2+ a u 2+ R N Peptidkette 2 R ier ist die Komplexbildung anhand zweier Peptidketten gezeigt. Die Wasserstoffatome an den Stickstoffatomen sind hier nicht aufgeführt. 2

3 1.6. Zusammenfassung/Diskussion Die Biuret-Reaktion ist eine typische Reaktion zum Nachweis von Proteinen. Die bestimmten Konzentrationen der Eichgeraden liegen fast alle genau auf der Geraden. Dies weist auf eine gute Durchführung des Versuchs und die Qualität der Biuret-Methode zur Proteinbestimmung hin. b) Proteinbestimmung nach Lowry 2.1. Einleitung Auch hier wird nach der Bestimmung der Eichgeraden die Konzentration zweier Lysozymlösungen bestimmt. Dieses Mal bedient man sich jedoch der Methode von Lowry Material und Methode Das bei diesem Versuch eingesetzte Material ist auf Seite 2 im Skript unter Reagenzien aufgezeigt. Das Verfahren der Photometrie wurde unter 1.2. bereits beschrieben! Die Photometrie wird bei einer Wellenlänge von 578 nm durchgeführt. Die Methode nach Lowry hat große Ähnlichkeit mit der Biuret-Reaktion. Die Methode wird im Unterpunkt 2.5. Auswertung kurz angerissen Versuchsdurchführung Siehe Skript! 2.4. Versuchsergebnisse L1 L2 L3 L4 L5 L6 Probe III Probe IV asein- Konzentration 0 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 0,11 0,33 in g/l Extinktion 0 0,165 0,3 0,41 0,645 0,84 0,24 0,71 Die Konzentration wird wie in Versuchsteil a) beschrieben berechnet. Die Formel der Eichgeraden lautet y = 2,1479 x. 3

4 Proteinbestimmung nach Lowry y = 2,1479x 1 0,9 0,8 0,7 0,6 Extinktion 0,5 0,4 0,3 0,2 0, ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 Konzentration in g / l 2.5. Auswertung Die Proteinbestimmung nach Lowry hat Ähnlichkeit mit der Biuret-Methode. Auch hier werden die Proteine mit Kupfer gefällt. Danach erfolgt allerdings noch eine Reduktion der Folin-iocalteu's- Phenol-Reagenz (Folin-Reagenz). Dabei wird das Molybdat bzw. das Wolframat reduziert und es erfolgt dadurch ein Farbumschlag nach blau. Die Extinktion ist proportional zur Intensität der Färbung und somit auch zur Konzentration der Proteinlösung Zusammenfassung / Diskussion Die Extinktion bei 0,05 und 0,1 g / l weichen von den anderen Werten der Eichgeraden drastisch ab. Trotzdem wurden sie bei der Erstellung der Eichgeraden berücksichtigt. Die Abweichungen der Werte könnten zum Beispiel durch den Einsatz von Phenolen hervorgerufen werden. Allerdings sind aber auch unsauberes Arbeiten und Pipetierfehler möglich. 4

5 c) Aminosäurebestimmung mit Ninhydrin 3.1. Einleitung Bei diesem Versuchsteil wird die Konzentration der Aminosäure Glycin bestimmt. Auch hier bedient man sich einer Eichgeraden, die vorerst durch bekannte Konzentrationen aufgestellt wird Material und Methode Die zu benutzenden Reagenzien sind auf Seite 3 im Skript unter Reagenzien aufgeführt. Die Photometrie wurde im Versuchsteil a) beschrieben. Der Reaktionsmechanismus ist im Unterpunkt Auswertung dargestellt Versuchsdurchführung Siehe Skript! 3.4. Versuchsergebnisse N1 N2 N3 N4 N5 N6 Probe V Probe VI asein- Konzentration ,53 32,98 in mg / L Extinktion 0 0,14 0,235 0,59 0,82 1,15 0,325 0,93 1,4 Aminosäurebestimmung mit Ninhydrin y = 0,0282x 1,2 1 Extinktion 0,8 0,6 0,4 0, Konzentration in mg / L 5

6 3.5. Auswertung Die Färbung der Lösung resultiert daraus, dass das Ninhydrin mit der Aminosäure in unserem Falle mit Glycin- reagiert. Dabei wird die Aminogruppe auf Ninhydrin übertragen und es entsteht ein Aminoketon. Unter hoher Temperatur reagiert das Aminoketon mit dem Ninhydrin zu einem blau-violetten Farbstoff, dessen Extinktion man nun messen kann. Auch hier gilt: Umso stärker die Färbung desto höher die Extinktion und die Konzentration der Glycin-Lösung. ier sind nun einzelne Reaktionsschritte dargestellt! + 2 N 2 N N hohe Temperatur N blauviolette Farbstoff 3.6. Zusammenfassung / Diskussion Auch bei diesem Versuch fallen einzelne Werte der Eichgeraden heraus, jedoch liegt es noch im Toleranzbereich. 6

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