TESTBLÄTTCHEN FUR ANTIBIOGRAMME KARTUSCHE MIT 50 TESTBLATTCHEN BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT GEGEN ANTIBIOTIKA
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- Liese Schräder
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1 TESTBLÄTTCHEN FUR ANTIBIOGRAMME KARTUSCHE MIT 50 TESTBLATTCHEN BESTIMMUNG DER EMPFINDLICHKEIT GEGEN ANTIBIOTIKA 1- KLINISCHE BEDEUTUNG Die werden zur semiquantitativen Bestimmung in-vitro-empfindlichkeit von schnell wachsenden Bakterien und mehrerer komplexer Spezies gegen Antibiotika im Agardiffusionstest verwendet. Diese Methode beruht auf einem standardisierten Verfahren, das von WHO (1) veröffentlicht und als gemeinsamer Standard von CLSI (2, 3), CA-SFM (4) und EUCAST (5) angepasst wurde (er wird regelmäßig überprüft). Die Richtlinien zum Anlegen des Antibiogramms und Interpretation Ergebnisse entnehmen Sie den neuesten CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) Dokumenten. 2- TESTPRINZIP Die mit definierten Antibiotika-Konzentrationen imprägnierten Papierblättchen werden auf die Oberfläche eines entsprechenden Mediums (A) aufgebracht, das zuvor mit einem kalibriertem Inokulum (A) einer frischen Reinkultur des zu testenden Bakterienstammes beimpft wurde. Nach Inkubation (A) werden die Petri-Schalen überprüft, die Hemmhöfe um die gemessen und für die Bestimmung Empfindlichkeit (resistent,mäßig empfindlich,empfindlich...) mit den kritischen Werten (A) für die verschiedenen getesteten Antibiotika verglichen. Der Durchmesser Hemmhöfe ist proportional zur Empfindlichkeit des getesteten Bakterienstammes. (A) gemäß den aktuellen Richtlinien CLSI (2, 3) CA-SFM (4) EUCAST (5). 3- INHALT DER TESTPACKUNG Die von Bio-Rad haben einen Durchmesser von 6,5 mm und sind aus hochwertigem Filterpapier. Sie sind jeweils exakt mit den definierten Konzentrationen an Antibiotika imprägniert. Die sind durch einen Code, aus 1 bis 3 Buchstaben besteht und auf jede Seite des Blättchens aufgedruckt ist, deutlich gekennzeichnet (siehe Tabelle 1). Die von Bio-Rad werden in Kartuschen mit jeweils 50 in wasserdichten Packungen mit Trockenmittel verpackt geliefert. Tabelle 1 : von Bio-Rad für das Antibiogramm KONZENTRATION DER SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. TESTBLÄTTCHEN Amikacin AN Amoxicillin 25 µg AMX Amoxicillin + Clavulanic Acid µg AMC Ampicillin 2 µg 10 µg AMN 2 AM Ampicillin + Sulbactam µg SAM Azithromycin 15 µg AZM Aztreonam ATM Bacitracin 1 / 10 UI B Carbenicillin 100 µg CB Cefaclor CEC Cefalexin CN Cefamandole MA Cefazolin CZ Cefepime FEP Cefixime 5 µg 10 µg CFM 5 CFM Cefoperazone 75 µg CFP 75 CFP Cefoperazone + Sulbactam 75 + SCF Cefotaxime 5 µg CTX 5 CTX Cefotetan CTT Cefoxitin FOX Cefpirome CPO Cefpodoxime 10 µg CPD Cefprozil CPR
2 KONZENTRATION DER SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. TESTBLÄTTCHEN Cefsulodin CFS Ceftazidime 10 µg CTZ 10 CAZ Ceftibuten CTB Ceftriaxone CRO Cefuroxime CXM Cephalotin CF Chloramphenicol C Ciprofloxacin 5 µg CIP Clarithromycin 15 µg CLR Clindamycin 2 µg CM Colistin 10 µg 50 µg CS 10 CS Doripenem 10 µg DORI Doxycycline DO Ertapenem 10 µg ETP Erythromycine 15 µg E Flumequine UB Fosfomycin 50 µg 200 µg FOS 50 FOS Fusidic Acid 10 µg FA Gentamicin 10 µg 15 µg / 10 UI GM GM GME Gentamicin (high load) 120 µg 500 µg GEN 120 GEN Imipenem 10 µg IPM Isepamicin ISP Kanamycin K Kanamycin (high load) 1mg KAN Levofloxacin 5 µg LVX Lincomycin 15 µg L Linezolid 10 µg LZD 10 LZD Mecillinam 10 µg MEC Meropenem 10 µg MEM Metronidazole 4 µg MTR Mezlocillin 75 µg MZ Minocycline MNO Moxalactam MOX Moxifloxacin 5 µg MXF Mupirocin 5 µg MUP Nalidixic Acid NA Neomycin 30 UI N Netilmicin 10 µg NET 10 NET Nitrofurantoin 100 µg NIF Nitrofurantoin 300 µg FT Nitroxolin 20 µg NI Norfloxacin 10 µg 5 µg NOR 10 NOR Ofloxacin 5 µg OFX Oxacillin 1 µg 5 µg OX1 OX Oxolinic Acid 10 µg OA Pefloxacin 5 µg PEF Penicillin 1 IU 6 µg / 10 IU P 1 P Pipemidic Acid 20 µg PI Piperacillin 75 µg 100 µg PIL 30 PIP 75 PIP
3 KONZENTRATION DER TESTBLÄTTCHEN Piperacillin + Tazobactam µg µg µg SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. PTZ 36 TZP 85 TZP Polymixin 50 µg / 300 UI PB Pristinamycin 15 µg PT Quinupristin-Dalfopristin 15 µg QD Rifampicin 5 µg RA 5 RA 30 Sparfloxacin 5 µg SPX Spectinomycin 100 µg SPT Spiramycin 100 µg SP Streptomycin 10 µg S Streptomycin (high load) 300 µg 500 µg STR 300 STR Sulfonamides 300 µg 200 µg SSS 300 SSS Teicoplanin TEC Telithromycin 15 µg TEL Tetracycline TE Ticarcillin 75 µg TIC Ticarcillin + Clavulanic Acid µg TCC Tigecycline 15 µg TGC Tobramycin 10 µg TM TOB Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1, ,75 µg SXT Trimethoprim 5 µg TMP Vancomycin 5 µg VA 5 VA * Die in Fettschrift angegebenen Konzantrationen entsprechen den CLSI Richtlinien. 4- LAGERUNG Das Verfalldatum gilt ausschließlich für aus intakten Kartuschen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers aufbewahrt werden. Das Verfallsdatum und die Seriennummer sind auf je Verpackung (Kartusche und Packung) angegeben. Die Kartuschen müssen in ihren Verpackungen an einem trockenen Ort bei einer Temperatur zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. Die Packung muss vor dem Öffnen Raumtemperatur (18-30 C) erreicht haben. Nach Anwendung müssen die nicht verwendeten Kartuschen wie zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. Die nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Verwenden Sie Kartuschen, die länger als 8 Stunden bei Raumtemperatur (18-30 C) aufbewahrt wurden erst, nachdem Sie überprüft haben, ob die Werte noch innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen (6). Entsprechen die mit den und Kontroll-Bakterienstämmen erzielten Hemmhöfe nicht den Spezifikationen, muss das Verfahren überprüft werden; dieser Fehler kann auf das, das Inokulum, die Beimpfung des Mediums o auf ane Faktoren zurückzuführen sein. Verbleibt die Kartusche nach Auslieferung im Lager, muss sie bei +2-8 C an einem trockenen Ort mit Trockenmittel aufbewahrt werden. Die Haltbarkeit von,die in den Kartuschen in einem Dispenser gelagert werden (gemäss Empfehlung mit einem Trockenmittel) wurde unter Routinebedingungen mit sechs Wochen ermittelt, mit Ausnahme mit dem Zeichen markierten Antibiotika-Teststreifen, en Stabilität unter Woche im Inneren dieses Zeichens angegeben ist. 5- BENÖTIGTE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN Blättchendispenser: 6-7 Blättchen Art.-Nr Blättchen Art.-Nr Kulturmedium (gemäß den aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) )) Reagenzien Bakterienstämme für die Qualitätskontrolle Trübungsstandard,entsprechend einem Mac Farland 0,5-Standard Laborausstattung zum Anlegen eines Antibiogramms im Agardiffusionstest 3
4 6- VORSICHTSMASSNAHMEN Beachten Sie die aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Beachten Sie stets die aktuellen Methoden und Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz vor mikrobiologischen Gefahren. Nach Verwendung die Kulturen und alle kontaminierten Materialien sterilisieren. 7- TESTDURCHFÜHRUNG Proben: Für direkt mit biologischen Proben durchgeführten Tests dürfen keine verwendet werden. Beachten Sie die aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ) hinsichtlich Vorbereitung des Inokulums aus einer frischen Reinkultur. Beachten Sie die von CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) empfohlene Anleitung bei Ausführung aller Schritte des Antibiogramms und Interpretation ebnisse: CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) Cempfehlen standardisierte Verfahren zur Vorbereitung des Inokulums, Beimpfung Petri-Schalen, Auswahl und Anordnung sowie Inkubationstemperatur und -zeit. Darüber hinaus sollten stets die GLP-Richtlinien beachtet werden. 8- INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Durchmesser Hemmhöfe exakt ausmessen und mit den kritischen Durchmessern aktuellen Richtlinien CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) vergleichen. Jedem Mikroorganismus ist eine Kategorie (mäßig resistent, empfindlich o nicht empfindlich...) in Funktion des erzielten Durchmessers und des kritischen Durchmessers für das getestete Antibiotikum zugeordnet. Diese Kriterien klinischen Kategorisierung gemäß kritischer Durchmesser werden regelmäßg von CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) überprüft. 9- TESTEIGENSCHAFTEN / QUALITÄTSKONTROLLE Die Testeigenschaften Antibiotika - werden mittels folgen Teststämme systematisch kontrolliert: - Escherichia coli - Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Neisseria gonorrhoeae ATCC Haemophilus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Clostridium perfringens ATCC Enterococcus faecalis ATCC Clostridium sporogenes ATCC In Tabelle 2 sind die Akzeptanzgrenzen für die im Agardiffusionstest für die Referenzstämme erzielten Durchmesser Hemmhöfe angegeben: Konzentration Standard Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC Amikacin CLSI Amoxicillin 25 µg Intern Amoxicillin + Clavulanic Acid 20/10 µg CLSI Ampicillin 10 µg CLSI Ampicillin + Sulbactam 10/10 µg CLSI Azithromycin 15 µg CLSI Aztreonam CLSI Bacitracin 10 UI Intern Carbenicilin 100 µg CLSI Cefaclor CLSI Cefalexin Intern Cefamandole CLSI Cefazolin CLSI Cefepime CLSI Cefixime 10 µg Intern Cefixime 5 µg CLSI Cefoperazone Intern Cefoperazone 75 µg CLSI Cefoperazone + Sulbactam 75/ Intern Cefotaxime CLSI Cefotetan CLSI Cefoxitin CLSI S. pneumoniae ATCC ATCC
5 Konzentration Standard Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC Cefpirome Intern Cefpodoxime 10 µg CLSI Cefprozil CLSI Cefsulodin Intern Ceftazidime CLSI Ceftibuten CLSI Ceftriaxone CLSI Cefuroxime CLSI Chloramphenicol CLSI Ciprofloxacin 5 µg CLSI Clarithromycin 15 µg CLSI Clindamycin 2 µg CLSI Colistin 10 µg CLSI Colistin 50 µg CA-SFM Doxycycline CLSI Ertapenem 10 µg CLSI Erythromycine 15 µg CLSI Flumequine Intern Fosfomycin 50 µg CA-SFM Fosfomycin 200 µg CLSI Fusidic acid 10 µg CA-SFM Gentamicin 10 µg CLSI Gentamicin 10 UI CA-SFM Imipenem 10 µg CLSI Isepamicin Intern Kanamycin CLSI Levofloxacin 5 µg CLSI Lincomycin 15 µg CA-SFM Linezolid CLSI Mecillinam 10 µg CLSI Meropenem 10 µg CLSI Mezlocillin 75 µg CLSI Minocycline CLSI Moxalactam CLSI Moxifloxacin 5 µg CLSI Mupirocin 5 µg Intern Nalidixic Acid CLSI Neomycin 30 UI Intern Netilmicin CLSI Nitrofurantoin 300 µg CLSI Nitroxolin 20 µg Intern Norfloxacin 5 µg Intern Norfloxacin 10 µg CLSI Ofloxacin 5 µg Intern Oxacillin 5 µg CA-SFM Oxacillin 1 µg CLSI Oxolinic Acid 10 µg Intern Pefloxacin 5 µg CA-SFM Penicillin 6 µg CLSI Pipemidic Acid 20 µg Intern Piperacillin 100 µg CLSI Piperacillin 75 µg Intern Piperacillin + Tazobactam 75/10 µg Intern Piperacillin + Tazobactam 100/10 µg CLSI S. pneumoniae ATCC ATCC
6 Konzentration Standard Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC S. pneumoniae ATCC ATCC Polymixin 300 UI CLSI Pristinamycin 15 µg CA-SFM Quinupristin-Dalfopristin 15 µg CLSI Rifampicin 5 µg CLSI Rifampicin CA-SFM Sparfloxacin 5 µg CLSI Spectinomycin 100 µg Intern Spiramycin 100 µg Intern Streptomycin 10 µg CLSI Sulfonamides 300 µg CLSI Sulfonamides 200 µg Intern Teicoplanin CLSI Telithromycin 15 µg CLSI Tetracycline CLSI Ticarcillin 75 µg CLSI Ticarcillin + Clavulanic Acid 75/10 µg CLSI Tigecycline 15 µg CLSI Tobramycin 10 µg CLSI Trimethoprim 5 µg CLSI Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1,25/23,75 µg CLSI Vancomycin CLSI Für die Kontrollgrenzen (internes Standards o CLSI) : Gentamicin 120 µg : E. faecalis ATCC (16-23 mm) Streptomycin 300 µg : E. faecalis ATCC (14-20 mm) Gentamicin 500 µg : S. aureus ATCC (30-34 mm) ; E. faecalis ATCC (18-28 mm) Kanamycin 1 mg : S. aureus ATCC ( 14 mm) ; E. faecalis ATCC ( 10 mm). Streptomycin 500 µg : S. aureus ATCC (24-28 mm) ; E. faecalis ATCC (14-25 mm). Metronidazole 4 µg : Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium sporogenes ATCC mm Cefoperazone + Sulbactam 75 / : ATCC (24-30 mm) Haemophilus ATCC kann bei Bestimmung wachstums-förnden Eigenschaften von HTM als zusätzlicher Kontrollstamm hilfreich sein. Trotz fehlen,verlässlicher Interpretationskriterien für die Ergebnisse im Agardiffuiosntest für S. pneumoniae gegenüber versch. Beta-Laktamen kann Streptococcus pneumonia ATCC als Kontrollstamm angesehen werden, für die Qualitätskontrolle für alle Streptococcus spp gleichermassen geeignet ist. Neisseria gonorrhoeae ATCC wird für den Test des Spectinomycin-s mit akzeptablen Durchmessern von 23 bis 29 mm empfohlen (CLSI). Ein evtl. Abbau 1 µg Oxacillin Konzentration eines s wird am besten mit dem Kontrollstamm Staphylococcus aureus ATCC mit einem akzeptablen Durchmesser von 18 bis 24 mm ermittelt. Gemäss den aktuellen EUCAST Richtlinien (Version1.2, 2010), ist die Funktionsfähigkeit von Antibiotikatestblättchen regelmässig mit Hilfe nachfolgend aufgeführten Referenzstämme zu überprüfen : - Escherichia coli - Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Enterococcus faecalis ATCC Haemophilus NCTC 8468 Tab. 3 enthält die jeweiligen Grenzwerte für Hemmhofdurchmesser im Agardiffusionstest mit den genannten Referenzstämmen.. Konzentration Akzeptable Durchmesser (mm) bei Qualitätskontrolle S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae ATCC ATCC ATCC NCTC 8468 E. faecalis ATCC Ampicillin 2 µg Cefotaxime 5 µg Ceftazidime 10 µg Doripenem 10 µg
7 Konzentration Akzeptable Durchmesser (mm) bei Qualitätskontrolle S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae ATCC ATCC ATCC NCTC 8468 E. faecalis ATCC Gentamicin Linezolid 10 µg Netilmicin 10 µg Nitrofurantoin 100 µg Penicillin 1 IU Piperacillin Piperacillin + Tazobactam 30/6 µg Tobramycin Vancomycin 5 µg QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle hergestellten o im Handel erhältlichen Reagenzien unterliegen einem umfassenden Qualitätssystem vom Empfang Rohmaterialien bis zur Vermarktung des Produktes. Jede Charge unterliegt einer Qualitätskontrolle und wird nur für den Markt freigegeben, wenn die Akzeptanzkriterien erfüllt sind.die Produkt- und Kontrolldokumentation zu je einzelnen Charge wird in Firma aufbewahrt. 11- GRENZEN DES VERFAHRENS Die klinische Einteilung Bakterien (in resistent, mäßig resistent, empfindlich...) hängt manchmal von einem einzigen Millimeter ab. Dies entspricht einem üblichen Fehlerbereich in einem Labor. Es können ane Antibiotika als die in Tabelle 2 angegebenen verwendet werden. Antibiogramme, bei denen diese Antibiotika verwendet werden, sollten auf Grundlage von Vorhandensein o Abwesenheit eines definierten Hemmhofes interpretiert werden und sollten lediglich als qualitativ betrachtet werden, bis Interpretationszonen festgelegt wurden. Alle Zonendurchmesser sollten erfasst werden. Die Leistung des Tests hängt nicht nur von Aktivität ab, sonn auch von Faktoren wie Verwendung eines geeigneten Inokulums und geeigneter Kontrollstämme, von geeigneten und zuvor validierten Kulturmedien sowie von einer adäquaten Lagerung. Die endgültige Interpretation kann, wie bei allen Laborinterpretationen, nicht nur auf Basis Ergebnisse eines einzelnen Tests erfolgen, sonn muss ggf. auch klinische Daten sowie biochemische, zytologische und immunologische Ergebnisse mit berücksichtigen. 12- LITERATUR 1. World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization Technical report series 822. W.O., Geneva. 2. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute Approved standard M2-A10. Performance standards for antimicrobial susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa. 3. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI document M100-S19. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 20th informational supplement, Wayne, Pa. 4. CA-SFM: Comité de l antibiogramme French Society of Microbiology. 5. EUCAST: European Committee on Antimicrobial susceptibility testing. EUCAST QC Tables V V. Loncle-Provot, E. Keller, M.O. Gourdin, M.L. Garrigues, Etude de la stabilité des disques antibiotiques dans les conditions d'utilisation en routine, 18th interdisciplinary meeting on anti-infectious chemotherapy, Paris, dec.3/ Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /
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