Sedimentation, Elektrophorese

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1 Sedimentation, Elektrophorese MEDIZINISCHE PHYSIK UND STATISTIK 2. Dr. Tamás Huber Institut für Biophysik 17. März Trennungsmethoden Trennverfahren in der Chemie oder Physik helfen dabei, zwei oder mehr Stoffe von einander zu trennen. ZENTRIFUGATION ELEKTROPHORESE CHROMATOGRAPHIE Biomoleküle können getrennt werden aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften: Ladung, Löslichkeit, Wechselwirkung mit spezifischen Reagenzien, Molmasse physikalischen Eigenschaften: Volumen, Dichte, Struktur 1

2 Einfache Trennungstechniken Beim Sedimentieren lässt man eine mit einem unlöslichen Feststoff verunreinigte Flüssigkeit, zum Beispiel eine Suspension, länger stehen, wobei sich der Feststoff als Sediment absetzt. Das Abgießen der überstehenden Flüssigkeit heißt Dekantieren. Die beiden Verfahren werden im Haushalt angewandt, wenn man den Kaffee vom Kaffeesatz abgießt. Sedimentation passiert in dem Gravitationsfeld (g)! Zentrifugation In dem Gravitationsfeld sind nur die aufgelösten Teilchen zwischen 2-50 μm fähig, zu sedimentieren. Um kleinere Moleküle zu sedimentieren, ist eine stärkere Feldstärke nötig. Blut vor (rechts) und nach (links) dem Zentrifugieren 2

3 Zentrifugen Auf die Partikeln wirkende Kräfte in dem Zentrifugationskraftfeld Zentrifugationskraftfeld = beschleunigtes Koordinatensystem F Z v m, ρ F R Zentrifugalkraft: F Z ist dem Schwerefeld proportional F Z nimmt im Verlauf der Sedimentation zu F A wirkt F Z entgegen F A ist abhängig vom Lösungsmittel F R wirkt F Z entgegen f ist abhängig von Form, Größe und Hydratation der Partikel F A ω Auftriebskraft: F A = ρ = Reibungskraft: 2 F z = mrω m ρ 2 0Vg ρ0 rω F R = fv 3

4 Sedimentationskoeffizient F R = F Z - F A = 2 m 2 = 2 ρ ω ω 0 fv mrω ρ0 r mr 1 ρ ρ Der Sedimentationskoeffizient S (Svedberg) beschreibt die Sinkgeschwindigkeit von Teilchen in der Ultrazentrifuge im Verhältnis zur Zentrifugalbeschleunigung. = (1 = ) Einheit: s = 1S [Svedberg] Aus dem Sedimentationskoeffizienten lässt sich bei Kenntnis des Diffusionskoeffizienten die Molmasse des gelösten Teilchens berechnen: = 1 = (1 ) = = ~ 6 Einstein-Stokes-Gleichung Differentielle Zentrifugation Separierte Zellkomponenten auf der Basis von Größe und Dichte. Homogenisierung: Die Plasmamembran der Zellen wird zerstört: - mit Ultraschall - mit osmotischem Schock - mit mechanischen Methoden Überstand Niederschlag Zellkerne sedimentieren bei Zentrifugation mit 1000 g für 5-10 Min; Mitochondrien, Lysosomen, Peroxisomen mit g für 15 Min und Mikrosomen, andere Vesikeln, Polymeren (z.b: Aktin Filamente) mit g für eine Stunde. 4

5 Dichtegradientenzentrifugation (Isopyknische oder Gleichgewichtszentrifugation) Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation (Glyzerin, Perkoll) ist (z. B. von 10% bis auf 30% Saccharose) schon vor Beginn der Zentrifugation eingestellt. Die Auftrennung der Stoffgemische erfolgt entsprechend den Svedberg-Werten: Moleküle mit hohem S-Wert sedimentieren rascher als solche mit geringerem S-Wert. Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation von den Zellen des Wildtyps und einer Mutante. CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugation zur Isolierung von Plasmid-DNA Bei der Aufreinigung von DNA im Caesiumchlorid-Gradienten werden Nukleinsäuren anhand ihrer Dichte getrennt. Das Prinzip der Trennung von chromosomaler und Plasmid-DNA erfolgt während der Zentrifugation in Gegenwart von Ethidiumbromid. Ethidiumbromid interkaliert zwar auch in Doppelstrang-DNA wie die kovalent geschlossene ringförmige Form (supercoil) des Plasmids, jedoch lagern lineare DNA-Doppelstränge oder durch einen Einzelstrangbruch geöffnete Plasmide (nicked circled-dna) erheblich mehr Ethidiumbromid ein, was die Schwimmdichte dieser DNA-Formen erhöht. 5

6 Noch ein Beispiel Elektrophorese Trennverfahrenim elektrischen Feld 6

7 Die Bewegung des geladenen Teilchens imelektrischenfeld v F C = QE = ZeE F R + F c F + Coulomb-Kraft: E = elektrische Feldstärke e = elementare Ladung Z = Zahl der Ladungen E Reibungskraft: F R = fv v = Wanderungsgeschwindigkeit f = Reibungskoeffizient Wie lange werden sich die Teilchen beschleunigen? F C = F R ZeE = fv Die elektrophoretische Mobilität Von der Feldstärkeneinheit bewirkte Wanderungsgeschwindigkeit: v u el = = E Ze f u el = Ze 6πη r Kugelförmiges Molekül: ZeE = 6πηru el (Stokes-Gesetz) Das Maß des Moleküls ist bestimmbar! 7

8 Agarose Gel-Elektrophorese Agarose (Polisaccharid) stellt die Hauptkomponente des Agars (aus den Rotalgen-Gattungen) dar. Es wird für Separation von Protein Komplexen, DNA und RNA verwendet. Rotalgen Unter UV - Licht 8

9 Polyacrylamidgelelektrophorese(PAGE) Die Gelelektrophorese wird zur Charakterisierung von Proteinen und zur Überprüfung von deren Reinheit eingesetzt. In einer radikalen Reaktion mit APS als Starter wird hierbei ein vernetztes Polymer gebildet. Der Vernetzungsgrad (und damit auch die Porengröße) ist von der Acrylamidkonzentration abhängig, die Polymerisationsgeschwindigkeit von der Temperatur und vom ph-wert. Detergenz SDS zerstört die Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine. - Nicht-kovalente Proteinaggregate werden aufgelöst - Proteine bewegen sich im Gel annähernd proportional zu ihrer Größe Da SDS negativ geladen ist, ist das Verhältnis von Ladung zu Größe für jedes Protein annähernd gleich. Durch den Vergleich mit einem Gemisch, das Proteine bekannter molekularer Massen enthält (der Protein- Standard), lässt sich die molekulare Masse unbekannter Proteine im Gel bestimmen. Arbeitet man unter reduzierten Bedingungen (Erhitzen, Zugabe von Dithiothreitol oder Mercaptoethanol), werden die Disulfidbrücken der Proteine gespalten. 9

10 Proteinfärbung Nachdem die Elektrophorese durchgeführt wurde, werden die Proteinbanden angefärbt. Dies geschieht meist durch den anionischen Farbstoff Coomassie- Blau. Dieser bindet an hydrophobe Bereiche der Proteine und macht diese somit sichtbar. Die Proteine werden vorher im Gel fixiert. Eine weitere Möglichkeit der Proteinfärbung ist die Silberfärbung. IEF Isoelektrische Fokussierung Wanderung der Proteine durch Gel mit ph-gradient bis zum PI. Stagnation am PI. Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen. 10

11 2D - Gelelektrophorese Serum-Eiweißelektrophorese Chronische Entzündung Normalbefund Antikörper-Mangel Syndrom 11

12 DANKE FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT! 12