Zytokine und Interferone - Bedeutung für die Diagnostik entzündlicher Erkrankungen

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1 Zytokine und Interferone - Bedeutung für die Diagnostik entzündlicher Erkrankungen Dr. med. Volker von Baehr Institut für Medizinische Diagnostik Berlin, Nicolaistraße 22, Berlin , info@inflammatio.de

2 Zytokine Peptidhormone, die im Rahmen von Entzündungsreaktionen von immunkompetenten Zellen produziert werden. man unterscheidet: Interferone, Interleukine, kolonie-stimulierende Faktoren, Tumor- Nekrosefaktoren und Chemokine Chemokine Name abgeleitet von chemotaktische Zytokine kleine Proteine ( Aminosäuren) Interferone Proteine oder Glykoproteine, mit einer immunstimulierenden, vor allem antiviralen und antitumoralen Wirkung vorrangig lymphozytärer Herkunft

3 Welche Zytokine haben Bedeutung in der Diagnostik? im Serum: Proentzündung: TNF- IL-1 IL-6 IL-8 (IFN-, IP-10 sil-2-rezeptor RANTES Antientzündung IL-10 TGF- Erfassung anderer Entzündungsphänomene: Histamin (Indikator der Mastzellaktivierung) Lp-PLA2 (Gefäßentzündung)

4 Welche Zytokine haben Bedeutung in der Diagnostik? in in vitro-stimulationstests: TH1/TH2/TH17-Profil / TH1/TH2-Profil IFN-, IL-4, IL-2, IL-17, IL-10 Untersuchung auf Wirksamkeit antientzündlicher Präparate TNF-, IL-4 (Hemmteste) Untersuchung auf Wirksamkeit immunmodulierender Präparate IFN-, IL-10 Effektorzelltypisierung (Typisierung allergen-/antigenspezifischer T-Lymphozyten) IFN-, IL-10 (IL-2, TNF- )

5 Serum-Zytokinanalysen

6 Bakterien LPS Pilze Partikel (z.b. Titanoxid) Immunkomplexe Makrophage TNF- IL-1 IL-6 IL-8 CRP Myelomonozytäre Entzündung Viren intrazellulär persistierende Bakterien Xenobiotika (z.b. Metalle, Acrylate, Biozide usw.) T-Lymphozyt IFN- (IP-10) IL-17 IL-4 IL-10 u.a. Lymphozytäre Entzündung (TH1-Immunaktivierung) Allergene (bei Sensibilisierung) Bakterien Pilze Xenobiotika (z.b. Flammschutzmittel, Biozide usw.) Mastzelle Histamin Leukotriene TGF- Serotonin u.a. Entzündung durch Mastzellaktivierung (Typ I)-allergische Entzündung

7 Das CRP ist zum Nachweis der chronischen Entzündung nicht ausreichend sensitiv! TNF- und IL-1 sind die Schlüsselzytokine der myelomonozytären Entzündung TNF- IL-1 IL-6 IL-10, TGF- Akute Phase- Reaktion CRP Entzündungsreiz (auf Einzelzellniveau) 90 2h 4h 8h 12h Tage

8 Allgemeines zu Zytokinen Hohe Sensitivität keine Organspezifität zirkulierende Zytokine werden von Leber und Nieren eliminiert, die Halbwertzeit im Serum liegt im Minutenbereich (Ausnahme: IP-10 und RANTES). Die ex-vivo-halbwertszeit ist dagegen vergleichbar zu anderen Serumproteinen. Wirkung der Zytokine auf ihre Zielzellen durch Rezeptorbindung: 1. membrangebundene Rezeptoren (Repertoire beschränkt) 2. lösliche Rezeptoren (z.b. sil-6r). Die entstehenden Komplexe binden an Zellmembranenen sehr vieler Zelltypen

9 Indikationen der Zytokinbestimmung im Serum Nachweis chronischer Entzündung (silent inflammation) TNF-, IL-1, IL-6, (RANTES) Nachweis der TH1-Immunaktivierung IP-10, (IFN- ) Nachweis gestörter Immuntoleranz IL-10, TGF- Nachweis der Krankheitsaktivität definierter Erkrankungen, z.b. Sarkoidose: sil2r (besser als ACE) Rheuma, Autoimmunerkrankungen u.a.: IL-6, IP-10 Kieferrestostitis (NICO): RANTES Nachweis der Tumornekrose IL-6 (besser als TNF- )

10 Silent inflammation, die schleichende Entzündung Kunststoffe Metalle Pilze Bakterien Viren Biozide Psychologischer Stress Mercaptane/Thioether EMF Industriegifte Lösungsmittel Weichmacher Nahrungsmittel Nitrosativer Stress Superoxid Mitochondriopathie Peroxynitrit inos Chronische Entzündung gestörte Immuntoleranz Oxidativer Stress Entwicklung weiterer Sensibilisierungen Abb. modifiziert nach Pall, Dr. (PhD) Lehrstuhl Biochemie an der Washington State University ML.:Explaining 'Unexplained Illnesses

11 Silent inflammation, die schleichende Entzündung Kunststoffe Metalle Pilze Bakterien Biozide Psychologischer Stress Mercaptane/Thioether EMF Industriegifte Lösungsmittel Weichmacher Viren Nitrosativer Stress + Nahrungsmittel Superoxid Mitochondriopathie Peroxynitrit inos Chronische Entzündung gestörte Immuntoleranz Oxidativer Stress Entwicklung weiterer Sensibilisierungen Abb. modifiziert nach Pall, Dr. (PhD) Lehrstuhl Biochemie an der Washington State University ML.:Explaining 'Unexplained Illnesses

12 Kunststoffe Metalle Pilze Bakterien Biozide Psychologischer Stress Mercaptane/Thioether EMF Industriegifte Lösungsmittel Weichmacher Viren Nitrosativer Stress Nitrotyrosin + Nahrungsmittel Superoxid inos Peroxynitrit Mitochondriopathie ATP intrazellulär Oxidativer Stress MDA-LDL Chronische Entzündung TNF- IP-10 Histamin gestörte Immuntoleranz Entwicklung weiterer Sensibilisierungen

13 Dieser Befund schließt eine chronische Entzündung weitestgehend aus

14 Mitochondriopathie und Oxidativer Stress sind (oft) Teil der systemischen Entzündung

15 Umweltschadstoffe UV-Licht Strahlung Autoantigene /Immunkomplexe Bakterien Partikel Hypoxie LPS ROS I B-Kinase Wirkung über Toll-like-Rezeptoren IkB- NF B p50 p65 Inflammation TNF-, IL-1 IFN-, IL-12, IL-6 p50 Genaktivierung p65 zeitversetzt: Antiinflammation IL-10, IL-1ra TGF- Die Bestimmung der NFkB-Aktivität gibt keine Aussage über die Entzündungslage, da pro- und antiinflammatorische Mediatoren vermittelt werden.

16 Die Labordiagnostik der chronischen Entzündung unterscheidet sich von der bei akuter Entzündung Akute Entzündung Chronische Entzündung CRP und andere Akute-Phase-Proteine der Leber Leukozytose TNF- Entzündung? IP-10 TH1-Immunaktivierung? Histamin Mastzellaktivierung? MDA-LDL Oxidativer Stress? Nitrotyrosin Nitrosativer Stress? ATP (in Leukozyten) Mitochondrienfunktion?

17 Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF- ) Multifunktionales Zytokin des Immunsystems, welches initial an allen lokalen und systemischen Entzündungen beteiligt ist. Quellen: Makrophagen >> Lymphozyten (TH1, TH0), Mastzellen >> Endothelzellen, Herzmuskelzellen, Fibroblasten, Nervenzellen Aktivierungswege: Toll-like Rezeptoren, MAP-Kinase-Weg, NF-κB Effekte: gemeinsam mit IL-1 Alarmzytokin im Organismus Effekte auf das Immunsystem, Nervensystem und Hormonsystem Vermittler von Krankheitsgefühl (Fieber, Fatigue, Anorexie, Libidoverlust) Vermittler kataboler Stoffwechselprozesse Testbesonderheiten (ELISA): Es werden auch die Abbauprodukte erfasst, daher höhere in vivo- Halbwertzeit als IL-1 und IL-6

18 TNF- fördert die Cortisolsynthese in der Nebenniere und hemmt die Synthese der Sexualhormone Nebenniere Gonaden Cholesterin TNF hydroxy-dhea Pregnenolon 17a-Hydropregenolon DHEA DHEA(S) Progesteron 17a-Hydroprogesteron TNF- TNF- Androstendion Östron 11-Desoxykortikosteron + 11-Desoxykortisol TNF- TNF- Kortikosteron 18-Hydroxy-Kortikosteron Kortisol Testosteron + 17 Östradiol Aldosteron Kortison TNF- Straub R.H. Pathophysiologie komplexer chronischer Erkrankungen, Band 1

19 TNF- fördert die Cortisolsynthese in der Nebenniere und hemmt die Synthese der Sexualhormone Nebenniere Gonaden Cholesterin TNF hydroxy-dhea Pregnenolon 17a-Hydropregenolon DHEA DHEA(S) Progesteron 17a-Hydroprogesteron TNF- TNF- Androstendion Östron 11-Desoxykortikosteron + 11-Desoxykortisol TNF- TNF- Kortikosteron 18-Hydroxy-Kortikosteron Kortisol Testosteron + 17 Östradiol Aldosteron Kortison TNF- Straub R.H. Pathophysiologie komplexer chronischer Erkrankungen, Band 1

20 Bei chronischer Entzündung zeigt sich oft ein erhöhtes Cortisol und ein vermindertes DHEAS im Blut

21 Auch moderate TNF- -Erhöhungen zeigen einen chronischen Entzündungsprozess an.

22 Interleukin-1-beta (IL-1 ) Zusammen mit TNF- multifunktionales Zytokin, welches an allen lokalen und systemischen Entzündungen beteiligt ist. Quellen: Makrophagen >> Endothelzellen, Fibroblasten Aktivierungswege: Toll-like Rezeptoren, MAP-Kinase-Weg, NF-κB Effekte: gemeinsam mit TNF- Alarmzytokin im Organismus Effekte auf das Immunsystem, Nervensystem und Hormonsystem Vermittler von Krankheitsgefühl (Fieber, Fatigue, Anorexie) Vermittler kataboler Stoffwechselprozesse Testeigenschaften (ELISA): Präanalytisch anfälliger als TNF-, daher nur erhöhte Werte aussagekräftig

23 TNF- und IL-1 sind die Schlüsselzytokine der systemischen klassischen Entzündungsreaktion Bakterien LPS Pilze Partikel (z.b. Titanoxid) Xenobiotika TNF- IL-1 s juan-gärtner@fotolia.com s marksykes@fotolia.com Aktivierung und Rekrutierung weiterer Immunzellen Fieber Fatigue Anorexie Immunkomplexe markus-schnatmann@fotolia.com Akute Phase- Reaktion / HHN-Achse- Stressantwort u.a.

24 Alle vermittelten Effekte sind sinnvoll bei einer akuten (notwendigen) Entzündungsantwort Knochen Osteoklastenaktivität Knochenresorption Parodontitis Osteoporose Schleimhaut/Haut Kollagenase u.a. ammp8 Proteinasen Gewebeabbau Muskel Proteinkatabolismus Schmerzwahrnehmung Muskelatrophie Fibromyalgie Fettgewebe Lipoproteinlipase Fettsäurefreisetzung Cachektin-Wirkung Immunsystem Anlockung weiterer Immunzellen (Chemotaxis) T-Zellaktivierung (IFN-g ) Adhäsionsmoleküle Verstärkung der lokalen Entzündung TNF- IL-1 Nervensystem Fieber, Anorexie Fatigue IDO-Aktivität Depression Gefäßendothel Adhäsionsmoleküle Arteriosklerose Schlaganfallrisiko Hormonsystem ACTH, Cortisol Sexualhormone Stresseffekte Mitochondrien ATP-Bildung

25 Interleukin-6 (IL-6) Zytokin mit pro- und antientzündlichen Eigenschaften ( Regulation ) Quellen: Monozyten/Makrophagen >> Epithel- und Endothelzellen kurzfristige Induktion auch durch Muskelbeanspruchung Die Bildung von Interleukin-6 wird durch Prostaglandin E 2 verstärkt. wichtigste Funktionen: Induktor der Akute-Phase-Proteine in der Leber Stimulation von B- und T- Lymphozyten IL-6 steigert die Sekretion von Kortison, Somatotropin, Glucagon und Adrenalin

26 Interleukin-8 (IL-8, CXCL8) Chemokin mit proentzündlichen Eigenschaften Quellen: Endothelzellen, Monozyten >> Epithelzellen und Fibroblasten Zielzellen und Effekte: Neutrophile Granulozyten Anlockung ins entzündete Gebiet (Chemotaxis) Endothelzellen Gefäßneubildung (Angiogenese) Besonderheit: IL-8 bindet im Blut an Erythrozyten daher IL-8 nach Vollblutlyse als empfindlichster Inflammationsmarker, Voraussetzung: Erythrozytenlyse < 2 h nach Blutabnahme, Serumbestimmung nur aus < 2 h abzentrifugiertem Serum möglich

27 Interleukin-10 (IL-10) Zytokin mit antientzündlichen Eigenschaften veraltet: Cytokine-synthesis inhibitory factor Quellen: Monozyten/Makrophagen >> T reg -Zellen, TH2-Lymphozyten Zielzellen und Effekte: gemeinsam mit TGF- verantwortlich für die Immuntoleranz hemmt die Bildung von IFN- in TH1-Lymphozyten und NK-Zellen stimuliert B-Lymphozyten zur Antikörperproduktion Immunmodulation in der Darmscheimhaut (NF B-Hemmung) hemmt die Antigenpräsentation von Monozyten hemmt die Aktivierung der Cyclooxygenase-2 in Monozyten

28 Transforming Growth Faktor beta (TGF- ) Wachstumsfaktor der als Homodimer im Blut vorliegt. Quellen: Makrophagen, dentritische Zellen, T reg -Zellen >> viele andere Zellen Zielzellen und Effekte: beeinflussen Zellproliferation und Zelldifferenzierung in vielen Zelltypen starke antiinflammatorische Wirkung auf TH1-Zellen vermittelt gemeinsam mit IL-10 die Immuntoleranz wichtige Rolle bei Heilungsprozessen, Kollagenbildung (Kollagen Typ I) und Fibrosierung von Gewebe Besondere Rolle bei Tumorerkrankungen initial: TGF-ß = Tumorsuppressor wegen antiproliferativer, proapoptotischer und antiangionetischer Wirkung später: Tumorzellen werden unsensibel (Escape-Mechanismus) TGF-ß fördert dann die Progression durch seine immunsuppressive (toleranz-induzierende) Wirkung

29 Erhöhte TGF- und IL-10-Blutspiegel sind im chronischen Verlauf bei Tumoren prognostisch ungünstig Eine Senkung durch immunstimulierende Massnahmen erscheint sinnvoll, auch wenn klinische Studien dazu bisher fehlen.

30 Bakterien LPS Pilze Partikel (z.b. Titanoxid) Immunkomplexe Makrophage TNF- IL-1 IL-6 IL-8 CRP Myelomonozytäre Entzündung Viren intrazellulär persistierende Bakterien Xenobiotika (z.b. Metalle, Acrylate, Biozide usw.) T-Lymphozyt IFN- (IP-10) IL-17 IL-4 IL-10 u.a. Lymphozytäre Entzündung (TH1-Immunaktivierung) Allergene (bei Sensibilisierung) Bakterien Pilze Xenobiotika (z.b. Flammschutzmittel, Biozide usw.) Mastzelle Histamin Leukotriene TGF- Serotonin u.a. Entzündung durch Mastzellaktivierung (Typ I)-allergische Entzündung

31 Interferon-gamma (IFN- ) Typ II-Interferon mit immunstimulierender, antiviraler und antitumoraler Wirkung Quellen: TH1-Lymphozyten (CD4 > CD8) >> CD28+/CD8+T-Lymphozyten, dentritische Zellen, NK-Zellen Zielzellen und Effekte: in Makrophagen Aktivierung, MHCII-Expression und Phagozytose, Bildung von NO, TNF- und IL-1-Sekretion in B-Lymphozyten Förderung des Klassenwechsel IgM IgG (d.h. Hemmung IgE) in TH2-Lymphozyten Hemmung der IL-4-Synthese (TH2-Hemmung) Aktivierung der 1α-Hydroxylase: 25(OH) Vitamin D3 1,25(OH)2Vitamin D3 Aktivierung der Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) in verschiedenen Zelltypen Tryptophan Kynurenine (Hemmung Serotoninsynthese)

32 IFN- (und auch TNF- induziert die Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) und hemmt so die Serotoninsynthese im ZNS Blut-Hirn-Schranke L-Tryptophan + IFN- +TNF- + Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) Serotonin Kynurenine Stimmung Schlaf Appetit Sexualverhalten Temperaturregulation Schmerzwahrnehmung Oxenkrug, Ann N Y Acad Sci 2010 Neurotoxische Wirkung Glutamat-Rezeptor-Wirkung Hemmung des Tryptophan-Transports über die Blut-Hirn-Schranke depressive Symptomatik

33 Deshalb sollte bei Serotoninmangel und erhöhter IDO- Aktivität Tryptophan erst nach der antientzündlichen Therapie substituiert werden!!!

34 Viele Symptome bei Multisystemerkrankungen werden durch Interferon-gamma vermittelt!

35 IP-10 ist ein IFN- -Biomarker idealer Serummarker für die TH1-Immunaktivierung aktivierte TH1-CD4-Zelle (IP-10 = IFN- -inducible protein 10) IFN- sehr niedrige und schwankende Serumspiegel IP-10 stabil im Serum messbar pg/ml im Serum IP-10-Spiegel im Blut IFN- Stunden Tage

36 TH1-dominante Entzündung Aktivierung von TH1-Lymphozyten IFN IP-10

37 Aber auch eine TH1-dominante Entzündung kann Ursache für oxidativen/nitrosativen Stress (seltener auch Mitochondriopathie) sein

38 Achtung: Andere T-lymphozytäre Zytokine wie IL-2, IL-4, IL-5, IFN- oder IFN- sind im Serum nicht in ausreichender Höhe messbar. Daher müssen in-vitro Stimulationsteste durchgeführt werden, welche die Zytokinausrichtung der T-Helferzellen verstärken.

39 TH2-Dominanz ist typisch für: atopische Disposition (IgE?, Eosinophilie?, allergenspezifische IgE?) Parasitose (IgE?, Eosinophilie?, Stuhlanalysen) chronische Entzündung (Profil Multisystemerkrankung, Ursachendiagnostik) assoziiert mit seltenen Immundefekten (v.a. im Kindesalter)

40 Durch Erweiterung des Profils können alle TH- Subpopulationen charakterisiert werden

41 CD4-Lymphozyten (Helferzellen) TH1-Helferzellen TH2-Helferzellen TH17-Helferzellen CD25+/CD127 T reg -Zellen Angriffszellen sezernieren IFN- Elimination von infizierten und veränderten Körperzellen Immunmodulierende Zellen sezernieren IL-4 und IL-5 Stärkung der Antikörperproduktion, auch IgE als verantwortlicher Antikörper für die Soforttypallergie Kontrollzellen sezernieren IL-17 Kontrolle von persistierenden Erregern Bremserzellen sezernieren IL-10 und TGF- Toleranzerhaltung, Verhinderung und Bremsung von Immunreaktionen T reg -Zellen im Darm = TH3-Zellen genannt

42 Im TNF-Hemmtest kann in vitro die individuelle Wirksamkeit von Präparaten auf die Entzündungsinduktion bestimmt werden Hemmwirkung 75% +18% 85% 94% +75% Hier wirkt Silymarin und Boswellia-Extrakt am stärksten antientzündlich. Hox alpha und Colibiogen wirken hier eher proentzündlich!

43 Damsgaard CT et al. Whole-blood culture is a valid low-cost method to measure monocytic cytokines - a comparison of cytokine production in cultures of human whole-blood, mononuclear cells and monocytes. J Immunol Methods. 2009;340: Basisansatz Zugabe der verschiedenen antientzündlichen Wirkstoffe in Parallelansätzen 50 Patientenblut 500 µl RPMI + LPS Mischung und Inkubation für 4h bei 37 C Zentrifugation Analyse von TNF- im Überstand TNF- Basiswert (gehemmte) TNF- -Werte

44 Das Ausmaß der entzündungshemmenden Wirkung der Präparate ist individuell n = 122 Patienten Curcumin Boswellia Resveratrol S-Adenosylmethionin Prednisolon Hemmung LPS-induzierte TNF- -Freisetzung im Vergleich zum LPS-Basalwert < 10% 10 50% > 50% Curcumin 17 % 47 % 36 % Boswellia 22 % 36 % 42 % Resveratrol 12 % 84 % 4 % SAM 17 % 24 % 59 % Prednisolon 3 % 22 % 75 % Institut für Medizinische Diagnostik Berlin, Nicolaistraße 22, Berlin , info@inflammatio.de

45 Zusammenfassung und Empfehlung Zytokindiagnostik ist essentiell für den Nachweis und das Monitoring chronischer Entzündungserkrankungen Zytokindiagnostik sollte aber gezielt eingesetzt werden: Nachweis der systemischen Entzündung: TNF- (ggf. auch IL-6 und IL-1) Nachweis der Antientzündung und der Immuntoleranz: IL-10, TGF- kompensatorischer Anstieg dieser Zytokine bei gestörter Immuntoleranz Nachweis der TH1-Immunaktivierung: IP-10 (im Serum) besser geeignet als IFN- Beurteilung der TH1/TH2-Balance erfolgt nur über Stimulationstests (TH1/TH2-Balance oder TH1/TH2/TH17-Test) Immer zu empfehlen: Zentrifugation des Blutes und Trennung vom Blutkuchen < 4 h, Einsendung ins Labor < 24 h (Abfall dann < 10%)