NOVA Lite Monkey Kidney IFA Kit/Slides Nur für In-Vitro Diagnostik Nur für Export. Nicht zum Verkauf in den USA.
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- Gabriel Beyer
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1 NOVA Lite Monkey Kidney IFA Kit/Slides Nur für In-Vitro Diagnostik Nur für Export. Nicht zum Verkauf in den USA. Bestell-Nr.: , , CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck Dieser Kit dient zum Screening auf zirkulierende Autoantikörper gegen die glomeruläre Basalmembran (GBM) im Humanserum. Informationen zum Test Anti-GBM Autoantikörper sind ein klassisches Beispiel für die pathologische Wirkung von Autoantikörpern, da diese eine rapid-progressive Glomerulonephritis mit oder ohne Lungenhämosiderose (Goodpasture- Syndrom) auslösen können. Sie werden typischerweise durch direkte Immunfluoreszenz auf Nieren- Biopsiematerial nachgewiesen. Die indirekte Immunfluoreszenz mit Affen-Niere-Gefrierschnitten als Substrat ist ein sehr guter Screening-Test. Ratten-Niere-Gefrierschnitte sollten nicht verwendet werden, da hier auch heterophile Antikörper im Bereich der glatten Muskulatur angefärbt werden und sie insgesamt eine geringere Sensitivität gegenüber anti-gbm-autoantikörpern aufweisen als die Affen-Niere. Diese Autoantikörper erkennen Epitope des Typ-IV-Kollagens, welche aufgrund der Faltung der Polypeptidkette häufig schwer zugänglich sind. Durch die Inkubation der Nierenschnitte mit einem konzentrierten Harnstoff-Puffer werden die Kollagenketten entfaltet und dadurch mehr Epitope zugänglich. Die Harnstoffbehandlung der Nierenschnitte erhöht die Sensitivität der indirekten Immunfluoreszenz und zusammen mit einem biotinyliertem Sekundärantikörper und fluoreszenzmarkiertem Streptavidin wird eine mit einem Enzym-Immunoassay vergleichbare Sensitivität erreicht. 1,2 Testprinzip Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik. 3 Die Patientenproben und entsprechenden Kontrollen werden auf dem Gewebesubstrat inkubiert. In einem Waschschritt werden die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Biotin-Konjugat zugegeben. Nach der Inkubation wird überschüssiges Konjugat durch Waschen entfernt und fluoreszein-markiertes Streptavidin aufgetragen. Ungebundenes Reagenz wird wie zuvor durch Waschen entfernt und die Untersuchung der Objektträger erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen im Bereich der Bindungsstellen zwischen dem Substrat und Antikörpern eine apfelgrüne Fluoreszenz. Inhalt der Testpackung 1. Objektträger (mit je 5 Auftragsstellen), mit Affen-Niere-Gefrierschnitten, in Folie eingeschweißt. Gilt nur für Kits : 2. Anti-GBM-Positivkontrolle (aus Humanserum gewonnen): erzeugt GBM-Muster auf der Affen-Niere. Vorverdünnt, gebrauchsfertig. 3. Negativkontrolle: ist negativ für alle Autoantikörper. Vorverdünnt, gebrauchsfertig. 4. PBS-Pufferkonzentrat: 40-fach konzentrierte phospatgepufferte Kochsalz-lösung (PBS-Puffer). 5. Affinitätsgereinigtes Schaf anti-human-igg-(h+l)-biotin-konjugat (affen-adsorbiert). Vorverdünnt, gebrauchsfertig. 6. Fluoreszein-markiertes Streptavidin-Konjugat. Vorverdünnt, gebrauchs-fertig. 7. Harnstoffpuffer: Vorverdünnt, gebrauchsfertig. 8. Evans Blue: 1%ige Evans-Blue-Lösung zur optionalen Gegenfärbung. 9. Blot-Papier. 10. Eindeckmedium: ist speziell für die Immunofluoreszenz, das Anti-Fadingreagenz enhält. 11. Deckgläschen Hinweise/Vorsichtsmaßnahmen Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede Einzelspende wurde mit Tests bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2), Hepatitis C-Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss von HIV, Hepatitis-C-Virus, Hepatitis B-Virus und anderen Infektionsträgern. Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiöses Material entsprechen und der Test nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die Evans-Blue-Lösung und die Kit- Kontrollen enthalten 0,09% Natriumazid als Konservierungsmittel. Deshalb sollten die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. 1
2 Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen Verwendungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen. Lagerung Der ungeöffnete Kit ist bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. NICHT EINFRIEREN. Nach dem Öffnen der Folienbeutel sollten die Objektträger sofort verwendet werden. Verdünnter PBS-Puffer kann bei 2-8 C bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Alle anderen Reagenzien bei 2-8 C lagern. Proben Blutproben über Venenpunktur sammeln und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8 C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden. 4 Für eine längere Lagerung empfiehlt es sich, die Seren aliquotiert bei mindestens -20 C einzufrieren. Serum nur einmal einfrieren und auftauen. Keine stark lipämische, hämolytische oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da dadurch erniedrigte Titer oder unklare Muster auftreten können. Testdurchführung Gelieferte Materialien (Kit) Monkey kidney 5-well slide (Affen-Niere-Objektträger mit je 5 Auftragsstellen) 1 1mL GBM Positive Control (Anti-GBM-Positivkontrolle - vorverdünnt, gebrauchsfertig) 1 1mL IFA System Negative Control (Negativkontrolle vorverdünnt, gebrauchsfertig) 1 3mL Anti-human IgG (H&L) Biotin Conjugate (anti-human-igg-(h+l)-biotinkonjugat) 1 3mL Streptavidin FITC (fluoreszeinmarkiertes Streptavidin-Konjugat) 1 1mL Urea Buffer (Harnstoff-Puffer) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung) 2 25mL PBS concentrate (x40) (PBS-Pufferkonzentrat - 40fach) 1 3mL PVA Mounting Medium (Eindeckmedium) 1 20 Blotters (Papier-Blotter) 1 10 Coverslips (Deckgläschen) 1 Arbeitsanleitung. Gelieferte Materialien (Objektträger) Affen-Niere-Objektträger mit je 5 Auftragsstellen Affen-Niere-Objektträger mit je 5 Auftragsstellen Zusätzliches benötigtes Material 1. Destilliertes oder deionisiertes Wasser zum Verdünnen des PBS-Pufferkonzentrats. 2. Behälter für PBS-Puffer. 3. Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren von Patientenproben. 4. Feuchte Kammer für die Inkubation 5. Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter. 6. Spritzflasche für den 1. Waschschritt mit PBS. Zusätzliche Komponenten können bei INOVA bezogen werden: PBS-Pufferkonzentrat (Bestell-Nr ), Negativkontrolle (Bestell-Nr ), GBM-Positivkontrolle (Bestell-Nr ), 1%ige Evans-Blue-Lösung (Bestell-Nr ) und Eindeckmedium (Bestell-Nr , ). Testdurchführung Qualitätskontrolle Positive und negative Kontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden. 1. Eindeckmedium: Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und es vor Gebrauch auf Raumtemperatur (18-28 C) erwärmen lassen. 2. PBS Konzentrat verdünnen. PBS-Konzentrat mit destilliertem oder deionisiertes Wasser 1/20 (1 Teil PBS-Konzentrat + 39 Teile destilliertes oder deionisiertes Wasser) verdünnen und mischen. Hinweis: Nur das gesamte Pufferkonzentrat verdünnen, wenn der Kit innerhalb von einem Monat verbraucht wird. Der gebrauchsfertige PBS-Puffer wird als Waschpuffer und Probendiluens verwendet. 3. Patientenproben verdünnen Screening: Verdünnung der Patientenproben mit PBS-Puffer im Verhältnis 1/5 (100µL Serum mit 400µL PBS-Puffer). Titration: Positive Proben (aus Screening) mit PBS-Puffer seriell verdünnen (z.b. 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 usw.) z. B. 100µL der 1/5-Patientenprobe + 100µL PBS-Puffer ergibt eine 1/10 Verdünnung, für die anderen Verdünnungsstufen entsprechend vorgehen. 2
3 4. Harnstoffbehandlung: Die verschlossenen Substrat-Objektträger-Folienbeutel vor dem Öffnen ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-28 C) liegen lassen. Auf jede Auftragsstelle 50µL des Harnstoffpuffers tropfen und den Objektträger in eine feuchte Kammer legen. 30 Minuten inkubieren. 5. Waschen mit PBS-Puffer: Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht direkt auf die Felder spritzen. Die Objektträger in eine Halterung geben, in ein PBS-Bad eintauchen und unter leichtem Rühren 5-10 min. waschen. Überschüssigen PBS-Puffer abschütteln und die Objektträger um die Auftragstellen herum abtrocknen. Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen. 6. Inkubation der Objektträger: Je einen Tropfen der Positiv- und Negativkontrolle, sowie je 50µL der verdünnten Patientenseren auf die entsprechenden Felder auftragen. 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-28 C) in einer feuchten Kammer inkubieren. 7. Waschen mit PBS-Puffer: Objektträger wie unter 5 beschrieben waschen. 8. Zugabe von Biotinkonjugat: Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort, d. h. innerhalb von 15sec, auf jede Auftragsstelle ein Tropfen des Biotinkonjugats zugeben. DIE AUF- TRAGSSTELLEN NICHT LÄNGER ALS 15sec UNBEDECKT LASSEN, da das Austrocknen des Substrats die Ergebnisse erheblich beeinträchtigen kann. 9. Inkubation der Objektträger: 30 Minuten bei Raumtemperatur (18-28 C) in einer feuchten Kammer inkubieren. 10. Waschen mit PBS-Puffer: Objektträger wie unter 5 beschrieben waschen. 11. Zugabe des fluoreszein-markierten Streptavidin-Konjugats: Auf jede Auftragsstelle ein Tropfen des fluoreszein-markierten Streptavidin-Konjugats tropfen. 10 Minuten bei Raumtemperatur (18-28 C) in einer feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren. 12. Waschen mit PBS-Puffer: Objektträger wie unter 5 beschrieben waschen. Ist eine Gegenfärbung mit Evans Blue gewünscht 2-3 Tropfen der 1%igen Evans Blue-Lösung auf 100mL PBS-Puffer zugeben. 13. Deckgläschen aufsetzen: Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBS-Pufferbad herausnehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und jeweils 1 Tropfen Eindeckmedium auf jede Auftragstelle geben. Das Deckgläschen sorgfältig auf den Objektträger legen, wobei Luftbläschen zu vermeiden sind. Eventuell vorhandene Luftblasen nicht versuchen zu entfernen Überschüssiges Eindeckmedium entfernen. 14. Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können bis zu 3 Tage bei 2-8 C ohne signifikanten Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden. Risultati Qualitätskontrolle Ein GBM-positives Serum zeigt eine starke, apfelgrüne Färbung der glomerulären Basalmembran. Die Negativkontrolle ergibt eine matt-grüne Färbung des Gewebes ohne eine erkennbare Fluoreszenz. Erscheinen die Kontrollen nicht wie beschrieben, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. Interpretation der Ergebnisse In Ref. 2 ist ein Beispiel für eine typische anti-gbm-anfärbung der glomerulären Basalmembran abgebildet. Ergebnisse werden als positiv oder negativ angegeben. Hinweis: Jedes Labor sollte selbst festlegen ab wann ein Ergebnis als klinisch relevant angesehen werden sollte. Grenzen des Verfahrens 1. Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst. 2. Die Verwendung dieser Produkte zusammen mit anderen Reagenzien für die Immunfluoreszenz wurde nicht geprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen. 3. Dieser Test allein ist nicht zur Diagnose ausreichend. Alle anderen klinische Daten wie Klinik des Patienten, andere serologische Tests oder Biopsien müssen berücksichtigt werden. Kurzarbeitsanleitung 1. Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen. 2. PBS-Pufferkonzentrat mit destilliertem oder deionisiertes Wasser verdünnen. 3. Patientproben 1/5 mit PBS-Puffer verdünnen. 4. Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und auf Raumtemperatur (18-28 C) erwärmen lassen. Objektträger aus der Folientasche nehmen und mit Harnstoff-Puffer vorbehandeln, waschen und abtrocknen. 5. Je 50µL der Kontrollen und Patientenproben auftragen. 6. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. 7. Objektträger mit PBS-Puffer (Spritzflasche) rasch abwaschen und für 5-10 min in einem PBS- Pufferbad waschen. 8. Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, wieder in die feuchte Kammer legen und sofort das Biotin- Konjugat auftragen. 9. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. 10. Objektträger wie unter Punkt 7 beschrieben waschen und abtrocknen. 11. Fluoreszein-markiertes Streptavidin-Konjugat auftragen und Objektträger 10 Minuten im Dunkeln in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren. 3
4 12. Objektträger wie unter Punkt 7 beschrieben waschen und abtrocknen. 13. Eindeckmedium auftropfen und Deckgläschen auflegen. 14. Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Referenzen 1. Yoshioka K., Michael A. F., Velosa J. and Fish A. J.: "Detection of hidden nephritogenetic determinants in human renal and non-renal basement membranes." Am. J. Pathol. 121, (1985). 2. Bradwell A. R., Stokes R. P., Mead G. P.: "Advanced Atlas of autoantibody patterns." 1999 Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. 3. Weller, T. H., Coons A. H.. "Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes-Zoster propagated in vitro."proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86, (1954). 4. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. NOVA Lite und INOVA Diagnostics, Inc. sind eingetragene Markenzeichen. Copyright 2013 Alle Rechte vorbehalten 4
5 Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: DEU December 2013 Revision 1 5
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