VL Genexpression Michael Altmann

Transkript

1 Institut für Biochemie und Molekularbiologie VL Genexpression Michael Altmann FS 2014

2 Vorlesung: Genexpression Fliessdiagramm der eukaryotischen Genexpression Die Expression eines Gens kann auf sehr verschiedenen Ebenen reguliert werden: Stabilität des DNS-Histonkomplexes Bildung des Initiationskomplexes der Transkription RNA-Prozessierung (vor allem Splicing), RNA-Export in das Cytoplasma Halbwertslebenszeit der RNA im Cytoplasma Effizienz der Translation (vor allem der Initiation) Posttraslationelle Modifikationen Proteinfaltung Halbwertslebenszeit der Proteinkette Die in der Regel signifikanteste Ebene der Regulation der Genexpression ist die Transkription, es können aber auch mehrere regulatorische Vorgänge gleichzeitig stattfinden, die eine Feinabstimmung der Aktivität eines bestimmten Genes zu einem gegebenen Zeitpunkt erlauben. Äussere Faktoren (Nahrungsmittel, Wachstumsfaktoren, etc.) und innere Bedingungen (Zellstadium, Differenzierung) bestimmen schlussendlich darüber, wieviel von einem bestimmten Genprodukt in jeder Zelle vorliegt. Aus: Genomes (2002), T.A. Brown

3 Initiation der eukaryotischen Transkription / Aufbau der Promotorregion Der Initiationskomplex der RNA-Polymerase II (transkribiert mrnas) - Transkriptionsstart ist bei +1. -Die RNA-Polymerase bedarf der allgemeinen Transkriptionsfaktoren, um an die Promotorregion der DNS zu binden. Die allgemeinen Transkriptionsfaktoren werden für die Transkription von allen Genen gebraucht (basale Transkription). - Zuerst bindet Transkriptionsfaktor TFIID an die TATA-Box (AT-reiche Sequenz mit niedriger Schmelzenergie), weitere TFIIs folgen in einer vorgegebenen Reihenfolge und erlauben die Bindung der RNA-Polymerase II. Weiterhin bindet am Initiationskomplex eine grössere Anzahl Mediatorproteine (M), die für eine effiziente Transkription gebraucht werden.

4 Die Transkription von hintereinander angeordneten rrna Genen"

5 Die zellspezifische Genexpression wird durch mehrere regulatorische Sequenzen / spezifische Transkriptionsfaktoren bestimmt

6 Spezialisierte Zellen exprimieren unterschiedliche Gene" ein" aus" ein" ein" aus" aus" aus" ein" aus" ein" ein" ein" Transcriptom Mit Hilfe von DNA-Mikroarrays oder sog. Genchips kann das mrna-expressionsprofil einer Zelle bestimmt werden und, somit, Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen erfasst werden

7 Initiation der eukaryotischen Transkription / Aufbau der Promotorregion Aufbau des Thymidinkinasepromotors (als Beispiel) - Oberhalb der TATA-Box befinden sich noch weitere Sequenzen wie zb. eine GC- oder CAAT-Box (sog. UAS (upstream activating sequences)), an die spezifische Transkriptionsfaktoren binden können, die die Effizienz der Transkription beeinflussen. Die Aktivität der UAS-Elemente ist positionsabhängig (sie können nicht entlang der Promotorregion ohne Veränderung der Aktivität verschoben werden). - Die Komplexität der Promotorregion (Anzahl und Position der UAS) ist je nach Gen sehr unterschiedlich, es können mehrere spezifische Transkriptionsfaktoren gleichzeitig miteinander interagieren.

8 Aufbau der Promotorregion/ Enhancer- bzw. Silencer-Elemente Funktion von Enhancer-Elementen bei der Transkription - Enhancer (Verstärker)-Elemente sind DNS-Abschnitte, die von spezifischen liganden-induzierbaren Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Enhancer können Hunderte von Basenpaaren vom Transkriptionsstart entfernt liegen; ihr Effekt ist meistens relativ positionsunabhängig. Die daran bindenden Transkriptionsfaktoren können die Effizienz der Transkription um einen Faktor x beeinflussen. - Die liganden-induzierbaren Transkriptionsfaktoren besitzen mehrere Eigenschaften: sie werden durch Liganden aktiviert (oft Hormone), sie binden an die Enhancer-DNS-Sequenz, sie können mit anderen Transkriptionsaktivatoren interagieren. - Neben Enhancer- gibt es auch Silencer (Dämpfer)-Elemente, die auch mit spez. Transkriptionsfaktoren interagieren. Sie haben den gegenteiligen Effekt auf die Transkription.

9 Aufbau der Promotorregion/ Enhancer- bzw. Silencer-Elemente Allgemeine Domänenstruktur der Steroidhormonrezeptoren - Als gut untersuchtes Beispiel von liganden-induzierbaren Transkriptionsfaktoren dient die Familie der Steroidhormonrezeptoren. Sie alle entstammen wahrscheinlich einem gemeinsamen Ur-Gen. - Wie der Darstellung zu entnehmen ist, haben alle diese Proteine einen ähnlichen Aufbau (die Proteine sind als Balken dargestellt, links ist das Amino-, rechts das Carboxyl-Ende). Am Aminoterminus befindet sich die jeweilige Bindungsstelle für die Transkriptionsaktivatoren, in der Mitte befindet sich die Enhancer-Bindungsstelle (ca. 70 Aminosäuren lang) und am Carboxyl-Ende die Bindungsstelle für den Liganden.

10 Hydrophobe Hormone als Liganden der nukleären Rezeptoren - Die hydrophoben Liganden / Hormone können die Zellmembran weitgehend frei passieren. Sie finden ihren Rezeptor im Cytoplasma oder im Zellkern vor und aktivieren ihn für die Beeinflussung der Expression spezifischer Gene. - Die ersten 6 Liganden sind Derivate von Cholesterin und heissen deshalb Steroidhormone. Östradiol, Testosteron und Progesteron sind Sexualhormone. Cortisol ist das wichtigste Glucocorticoid-Hormon, Aldosteron das wichtigste Mineralocorticoid. 1,25-Dihydroxycholecalciferol kann sowohl vom menschl. Körper aus Squalen wie aus den Vorstufen Vitamin D2 (Ergocalciferol) und Vitamin D3 (Cholecalciferol) hergestellt werden. - Tri-Iodothyronin, das Schilddrüsenhormon, ist ein hydrophobes Derivat der aromatischen Aminosäure Tyrosin. - Vitamin-A-Säure-Derivate (sog. Retinoide) werden im Körper aus Retinol oder aus Carotin hergestellt. - Prostaglandin J 2 ist ein Derivat der ungesättigten Arachidonsäure. Die Substanz wird in denselben Zellen produziert, wo sich der zu aktivierende Rezeptor befindet.

11 DNS-Bindungsdomäne von Rezeptoren/ Aktivierung des Glucocorticoid-Rezeptors DNS-Bindungsdomäne des Glucocorticoid-Rezeptors (Beispiel) - Es gibt verschiedene Protein-Motive, die die Bindung an Enhancer-DNS ermöglichen: sog. Leucin-Zipper, Helix-Loop-Helix-Motive, Zinkfingermotive. - Viele DNS-und RNS-bindende Proteine enthalten ein sog. Zinkfingermotiv (siehe Abb. Links; dabei sind Cystein- und Histidin-Reste involviert), so zb. der Glucocorticoid-Rezeptor (siehe Abb. rechts). Zwei Proteineinheiten, die jeweils 2 Zn-Ionen binden, dimerisieren und binden somit an den Enhancer (Sequenz: TGGTACAAATGTTCT). - In Abwesenheit von Zn-Ionen und/oder Liganden verändert sich die Struktur des Rezeptors, der Komplex zerfällt und löst sich von der DNS.

12 Homöoproteine steuern die Embryonalentwicklung Wie bei Prokaryoten finden sich bei Eukaryoten spezifische Transkriptionsfaktoren, die ein HTH (Helix-Turn-Helix)-Proteinmotiv besitzen, mit dem sie an spezifische DNA-Sequenzen binden. Zu der Kategorie der HTH-Proteine gehören sog. Homöobox-Proteine, die die Embryonalentwicklung steuern. Deren charakteristisches konserviertes HTH-Motiv besteht aus drei helikalen Abschnitten, die sich in der grossen Furche der DNA einbetten (siehe Abbildung). Homöobox-Gene (abgekürzt Hom- oder Hox-Gene) kontrollieren den Bauplan eines Organismus. Sie dienen als Steuer- oder Selektorgene (Master Control Genes), die die Expression anderer nachgeschalteter Gene, so z.b. weiterer Transkriptionsfaktoren, regulieren. Manche Selektorgene können ihre eigene Aktivierung aufrechterhalten, indem der Transkriptionsfaktor auch sein eigenes Gen einschaltet (siehe Abb.). Das Steuergen eyeless führt zur Produktion von ektopischen (nicht am physiologischen Ort befindlichen) Augen an den Flügel- und Antennen-ansätzen einer transgenen Linie der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (Pfeile), bei der der eyeless- gegen einen in verschiedenen Zellen induzierbaren Promoter ausgetauscht wurde. eyeless kann in der Fliege durch das orthologene Gen aus der Maus oder dem Menschen mit gleichem Resultat ersetzt werden. Das beweist, dass der Bauplan des Auges evolutiv stark konserviert ist. Halder et al. (1995), Science 267, Müller & Hassel, Entwicklungs- und Reproduktionsbiologie, 5. Aufl. 2012

13 Enhancer/Silencer-Sequenzen binden spezifische Transkriptionsfaktoren " Nucleäre Rezeptoren binden als Dimere an die DNA und beeinflussen dadurch die Genexpression. Sie erkennen zwei benachbarte DNA-Sequenzen, die in der Regel aus je 6 Basenpaare bestehen, die repetiert sind." " Enhancer/Silencer-Sequenzen: Wir unterscheiden zwei Typen von repetierten Sequenzen, direkte und inverse Repeats. Es gibt eine grosse Vielfalt an verschiedenen Enhancer-Sequenzen, die spezifische Transkriptionsfaktoren binden. " " Es bilden sich sowohl homo- wie auch heterodimere Komplexe von Rezeptoren. Letztere bestehen aus zwei verschiedenen Proteinen mit unterschiedlichen Liganden. In der Abb. ist der Retinsäure-Rezeptor RXR (siehe weiter unten) gezeigt, der als Heterodimer mit anderen Rezeptoren vorkommen kann." "

14 DNS-Bindungsdomäne von Rezeptoren/ Aktivierung des Glucocorticoid-Rezeptors Aktivierung des Glucocorticoid-Rezeptors - In der inaktiven Form liegt der Rezeptor im Cytoplasma gebunden an das Hitzeshockprotein Hsp90 vor. - Wenn das Steroidhormon Cortisol in die Zielzelle gelangt, bindet es an den Rezeptor, was zur Dissoziation des Proteinkomplexes führt. Der ligandengebundene Rezeptor wandert durch die Poren in den Kern und dimerisiert. Dort bindet er an die Enhancer-Sequenz (HRE) von zu aktivierenden Genen (zb. Enzyme der Gluconeogenese).

15 Möglichkeiten posttranslationeller Modifikationen (Auswahl) aus Krauss, 3rd ed, p. 56 Mögliche Modifikationen von Histon-Proteinen (Beispiel) - Verschiedene Aminosäure-Reste von Proteinen können posttranslationell kovalent modifiziert werden und dadurch in ihrer Aktivität beeinflusst werden (positiv oder negativ). - Eine häufig vorkommende Modifikation ist die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Resten (auch Histidin, Asparagin- und Glutaminsäure kommen in Frage), die mit Hilfe von ATP und Proteinkinasen stattfindet. Als Gegenspieler der Kinasen kommen in der Zelle spezifische Protein-Phosphatasen vor. - Weitere mögliche Modifikationen von Proteinen: Prenylreste und Fettsäuren -> verankern oft Proteine an Membranen Glycosylierung (N- oder O-glykosidisch; findet im ER statt) -> findet bei sekretorischen und membranständigen Proteinen statt.

16 Möglichkeiten der Regulation der Genexpression 1. Epigenetik: Methylierung von DNS führt zur Reduktion der Genexpression 2. Acetylierung / Deacetylierung von Histon-Proteinen beeinflusst die Stabilität von Protein / DNS Komplexen und somit die Effizienz der Transkription 3. MicroRNAs unterdrücken posttranskriptionell die Expression spezifischer Gene Aus: Der zweite Code (2009), P. Spork

17 Die Methylierung von CG-reichen Regionen 5 -CG-3 -reiche Regionen, CpG-Inseln, sind häufig 5 -stromaufwärts (Promoterregion) von Strukturgenen anzutreffen. Mit Hilfe einer Methyltransferase werden häufig Cytosin-Reste zu 5 - Methylcytosin solcher CpG-Inseln methyliert. Diese postreplikative Modifikation hat keinen Einfluss auf die Basenpaarung. An die methylierten Basen bindet das regulatorische Protein Methyl- CpG-Bindungsprotein (MeCP) und blockiert die transkriptionelle Aktivität der betroffenen Gene. Methylierungsmuster von CpG-Inseln werden nach der Replikation in den neu synthetisierten DNA-Strängen enzymatisch wiederhergestellt. Genomic Imprinting: aufgrund unterschiedlicher Methylierungsmuster werden das gleiche Allel paternaler und maternaler Gene unterschiedlich stark exprimiert. Dies betrifft allerdings nur ca. 1% der Gesamtheit der menschlichen Gene. Epigenetik: Die Regulation der Genexpression durch unterschiedliche Methylierungsmuster von CpG-Inseln ist ein wichtiges neues Forschungsgebiet der Medizin (siehe Artikel Neue Wege zur Krebsdiagnose, NZZ vom 18. November 2009).

18 Aktivierung der Genexpression durch Acetylierung von Histonen Aktivierung der Genexpression -Die Acetylierung von Histon-Proteinen verändert deren basischen Charakter (DNS-Histon-Komplex zerfällt). Nukleosomen werden dadurch aufgelockert und die Transkription spezifischer Gene stimuliert, wofür spezifische Transkriptionsfaktoren mit Acetylase-Aktivität gebraucht werden. -Entsprechend gibt es spezifische Deacetylasen, die als Hemmer der Transkription wirken.

19 RNA-Interferenz ermöglicht die Herabsetzung der Genexpression Regulation der mrna-stabilität Im Genom der meisten pflanzlichen und tierischen Zellen finden sich Gene, die nicht für Proteine kodieren, sondern für sog. micrornas (mirnas). In ca. 20% der proteincodierenden menschlichen Gene finden sich auch Vorläufer von micrornas in Introns von Genen. Die durch RNA-Polymerase II transkribierten Vorläufer der micrornas (in der Abb. auch als sirna bekannt) bilden aufgrund von komplementären Basenpaarungen doppelsträngige RNAs, die in mehreren Schritten (teils im Zellkern, teils im Cytoplasma) von Enzymkomplexen wie Dicer zu einer ca. 21 Nukleotid langen doppelsträngigen mirna prozessiert werden. Der Doppelstrang assoziert mit RISC, einem Proteinkomplex, der diesen auftrennt (Helicase) und einen Einzelstrang an komplementäre mrna- Sequenzen hybridisieren kann. Daraufhin kommt es zu einem Abbau der Ziel-mRNA durch RISC (Rnase- Aktivität). mirnas/sirnas werden heutzutage oft in Zellen transfiziert, um spezifische Gen-Aktivitäten auszuschalten (sog. Knock-down Technologie).

20 Beschleunigter Proteinabbau mit Hilfe der 26S-Proteasomen Querschnitt des aus vier Ringen bestehenden Zylinderteils - 26SProteasomen sind cytoplasmatische Proteasenkomplexe. Sie bestehen aus 2x 19S- Deckel teilen und einem 20S zylinderförmigen Mittelteil aus vier Ringen. - Die 19S Deckelteile bereiten unter ATP-Verbrauch die abzubauenden Proteine für den Abbau vor (Entfaltung). -In den inneren Ringen des 20S-Zylinders befinden sich die verschiedenen endoproteolytischen Aktivitäten (Trypsin-, Chymotrypsin- und PGPH (Peptidyl-Glutamyl-Peptid-hydrolyierende)-Aktivität), die die entfaltenen Proteinketten zu Peptidfragmenten von ca. 10 AS spalten.

21 Beschleunigter Proteinabbau mit Hilfe der 26S-Proteasomen Mechanismus der Ubiquitinylierung und Recyclierung des Ubiquitins - Ubiquitin ist ein evolutionär stark konserviertes Peptid (ca. 80AS), das über dessen C-terminales Glycin-Rest an Lysin-Reste (ε-aminorest) von abzubauenden Proteinen angehängt wird (Isopeptidbindung). Dadurch wird das Protein für den proteasomalen Abbau markiert. - E1/E2-Enzyme: Das carboxyterminale Glycin des Ubiquitins wird zu Aminoacyladenylat (ATP-Verbrauch) aktiviert und als Thioester an das Transferprotein E1 angehängt und auf das Transferprotein E2 übertragen. -E3-Enzym: Eine Reihe von verschiedenen E3-Enzymen übertragen das aktivierte Ubiquitin von E2 an spezifische Proteine und katalysieren die Bildung der kovalenten Isopeptidbindung. Anschliessend werden weitere Ubiquitinreste (Oligoubiquitin) angehängt, die von den 19S-Proteasom-Deckeln gebunden werden. Das oligoubiquitinierte und ungefaltene Protein wird in den Zylinder importiert und abgebaut. Nach vollendetem Abbau werden die abgespaltenen Ubiquitin-Reste für weitere Abbau-Zyklen eingesetzt.

22 Die Zahl der Proteine ist viel grösser als die der Gene Auch wenn die Zahl der proteincodierenden menschlichen Gene auf ca beschränkt, ist die Gesamtzahl der daraus entstehenden Proteine (das Proteom) mindestens 40-50x grösser. Grund dafür sind posttranskriptionelle und posttranslationelle Modifikationen. Wichtigste posttranskriptionelle Modifikationen: alternatives Splicing (zb. Exon1 wird nicht mit Exon2 sondern mit Exon3 fusioniert) und RNA- Editing, die oft gewebe-spezifisch geschehen. Wichtigste posttranslationelle Modifikationen sind: - Limitierte Proteolyse (zb. bei der Aktivierung von pankreatischen Proteasen) - Chemische Modifikationen: es gibt mehr als 500 bekannte chemische Modifikationen von Proteinketten (zb. Phosphorylierung von Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Resten), die deren Eigenschaften massgeblich prägen.