STICKSTOFFMONOXYD (NO) Intra- und interzellulärer Botenstoff. - Nicht nur im Gefäßsystem -

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1 STICKSTOFFMONOXYD (NO) Intra- und interzellulärer Botenstoff - Nicht nur im Gefäßsystem -

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3 Chemische und physikalische Eigenschaften von N=O. - Radikalisches Gas (ungepaartes Elektron) - - relativ unreaktiv im Vergleich zu z.b. Superoxydanion (O ) - hoch diffussibel auf Grund des niedrigen MW, Hydrophobizität und Löslichkeit - t1/2 = sec. Inaktivierung zu nicht reaktivem Nitrit (NO -) oder Nitrat (NO -) oder Umwandlung zu reaktivem NO oder NO 3 - kein "echter" Rezeptor, Wirkung durch Nitrosylierung von z.b. Metallen, SH-Gruppen (Cystein) - hohe Affinität zu Häm-Gruppen

4 Historie der Entdeckung von NO als zelluläre Signalsubstanz Seit Beginn des Jahrhunderts: - Einsatz von Nitroverbindungen wie Nitroglycerin oder Nitroprussit bei der Behandlung von Angina und anderen koronaren Herzkrankheiten als vasodilatorische Medikamente : - Entdeckung von cyclischem GMP - Guanylylcyclase - cgmp abhängiger Proteinkinase (PKG) - cgmp-spezifischer Phosphodiesterase Nobelpreis Furchgott, Ignarro and Murad für Arbeiten zu NO als cgmp vermittelte, vasodilatorische Signalsubstanz (EDRF = Endothelium-Derived-Relaxing-Factor)

5 NO-regulierte oder modulierte Prozesse Proliferation von glatten Muskelzellen Muskelrelaxierung (glatte Muskulatur) Entzündung. N=O Apoptose Zytotoxizität (Tumor, Pathogens) Plättchenaggregation

6 NO-Synthese aus Arginin und Sauerstoff durch NO-Synthasen (NOSs) 1. Für Oxygenase-Reaktion die Redox-Reaktionen werden benötigt: Einbau von molekularem Sauerstoff 1. Substrat: L-Arginin 2. molekularer Sauerstoff 3. Elektronen Donor: NADPH 4. Cofaktoren: Häm, FAD, FMN, Tetrahydrobiopterin 2+ und Ca /Calmodulin 2. Reductase-Reaktion Freisetzung von NO

7 NO-Synthese aus Arginin und Sauerstoff durch NO-Synthasen (NOSs) Für die Redox-Reaktionen werden benötigt: 1. Substrat: L-Arginin 2. molekularer Sauerstoff 3. Elektronen Donor: NADPH 4. Cofaktoren: Häm, FAD, FMN, Tetrahydrobiopterin 2+ und Ca /Calmodulin

8 Struktur NO-Synthase (NOS) NH2 NH2 COOH COOH Oxygenase-Domäne Bindungsstellen: - Häm -Tetrahydrobiopterin - Substrat regulatorische Domäne Calmodulin-Bindungsstelle Reductase-Domäne Bindungsstellen: - FAD - FMN - NADPH

9 Nitric Oxide Synthase Isoformen Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW (kda) Gewebe (Zellen) NOS I bnos Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn, periphere Neuronen, Inselzellen NOS II inos Zytosol Expression induziert durch Cytokine und Endotoxin 125 Macrophagen, Hepatozyten, glatte Muskelzellen, etc. NOS III enos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen, Nierenepithel

10 Nitric Oxide Synthase Isoformen Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW (kda) Gewebe (Zellen) NOS I bnos Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn, periphere Neuronen, Inselzellen NOS II inos Zytosol Expression induziert durch Cytokine und Endotoxin 125 Macrophagen, Hepatozyten, glatte Muskelzellen, etc. NOS III enos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen, Nierenepithel

11 Aktivierung von inducible NOS (inos) durch transkriptionale Induktion Cytokine (IL-1ß, TNF ), LPS a Macrophage Hepatozyt PM R NO INOS inos - Menge an gebildetem NO ca x höher als bei enos und bnos - nur als Dimer aktiv - pathophysiologische NOS - Verantwortlich für z.b. septischer Schock verbunden mit Multi-Organversagen TF (z.b NF kb) + _ inos mrna Glucocortikoide INOS

12 Nitric Oxide Synthase Isoformen Isoform Bezeichnung Zellfraktion Regulation MW (kda) Gewebe (Zellen) NOS I bnos Zytosol Ca2+/Calmodulin 155 Gehirn, periphere Neuronen, Inselzellen NOS II inos Zytosol Expression induziert durch Cytokine und Endotoxin 125 Macrophagen, Hepatozyten, glatte Muskelzellen, etc. NOS III enos Membrangebunden Ca2+/Calmodulin 135 Endothelzellen, Nierenepithel

13 2+ Aktivierung von enos durch Ca/Calmodulin Hormon Ca 2+ PM R [Ca] 2+ Ca 2+ NOS NOS aktiv Ca 2+ NO enos - constitutiv exprimiert - Membranverankerung durch Myristinsäure - nur als Dimer aktiv - Calmodulin Bindungs Domäne

14 Aktivierung von enos durch Ser-Phosphorylierung Hormon Ca 2+ PM R [Ca] 2+ Ca 2+ NOS NOS S aktiver Ca 2+ enos NO - Membranverankerung durch Myristinsäure - constitutiv exprimiert - Calmodulin Bindungs Domäne - - nur als Dimer aktiv P

15 Inaktivierung von enos durch Thr-Phosphorylierung Hormon Ca 2+ PM R Ca 2+ [Ca] 2+ enos Ca 2+ NOS NOS NO P T S inaktiv - Membranverankerung durch Myristinsäure - constitutiv exprimiert - Calmodulin Bindungs Domäne - - nur als Dimer aktiv P

16 NO-Biochemische Interaktionen Metalloproteine (Fe-S Gruppen) Lipide (Peroxydation) Guanylycyclase +. N=O DNA (Strangbrüche) Enzymaktivitäten Mitochondriale Atmungskette

17 . Guanylylcyclasen GTP cgmp + PPi 1. Membrangebundene Guanylylcyclase = Guanylylcyclase-Rezeptoren Transmembranrezeptoren mit intrinsischer, intrazellulärer Guanylylcyclase Aktivität - Rezeptoren für Natriuretische Peptide z.b. ANP: (Synthese und Wirkung im Herz und Intestinaltrakt) - nicht durch NO stimulierbar 2. Cytosolische Guanylylcyclase = NO-regulierte Guanylylcyclase

18 NO-regulierte, lösliche Guanylylcyclase - Heterodimer aus 76 kda a-untereinheit und 80 kda ß-Untereinheit - je eine Häm-Bindungs Domäne und eine katalytische Domäne - nur als Dimer aktiv - die katalytische Aktivität wird durch die NO-Bindung an die Häm-Gruppe 200-fach gesteigert (Vmax und Km) - cytosolisch lokalisiert, Isoformen auch membranverankert

19 Protein Targets von cgmp

20 cgmp-abhängige Kinasen (cgki und II) cgki - Serin/Threonin Kinase - starke Expression in: glatte Muskelzellen, Plättchen, Nierengefässe, etc. NH2 NH2 COOH COOH N-terminale Domäne regulatorische Domäne 1. Dimerisierung - 2 cgmp-bindungsstellen 2. Aktivierung/Inhibition 3. Targeting katalytische Domäne

21 Funktionen cgmp-abhängiger Kinasen - cgki und cgkii -

22 Ca 2+ -abhängige Kontraktion/Relaxierung der glatten Muskulatur

23 2+ Modulation der Ca -abhängigen Muskelkontraktion durch cgmp-abhängige Proteinkinase (cgki) 2+ - Inhibition der Ca -Freisetzung durch cgki-phosphorylierung: 1. IRAG: IP3-Rezeptor-assoziiertes cgki Substrat BKCa: Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von 2+ L-Ca -Kanälen 3. MBS/PP1M: Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase

24 2+ Modulation der Ca -abhängigen Muskelkontraktion durch cgmp-abhängige Proteinkinase (cgki) 2+ - Inhibition der Ca -Freisetzung durch cgki-phosphorylierung: 1. IRAG: IP3-Rezeptor-assoziiertes cgki Substrat BKCa: Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von 2+ L-Ca -Kanälen 3. MBS/PP1M: Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase

25 2+ Modulation der Ca -abhängigen Muskelkontraktion durch cgmp-abhängige Proteinkinase (cgki) 2+ - Inhibition der Ca -Freisetzung durch cgki-phosphorylierung: 1. IRAG: IP3-Rezeptor-assoziiertes cgki Substrat BKCa: Ca -abhängige K -Kanäle, Hyperpolarisierung, Inhibition von 2+ L-Ca -Kanälen 3. MBS/PP1M: Myosin-binding-unit der Myosin-Protein-Phosphatase Aktivierung

26 Protein Targets von cgmp 5 GMP cgmp

27 cgmp und Phosphodiesterasen (PDE) Feedback-Loops und signal cross-talk PDE I: Ca2+/Calmodulin abhängig PDE II: cgmp-stimmulierbar, nicht selektiv: Crosstalk mit camp-signalweg PDE III: cgmp-inhibiert, nicht selektiv Crosstalk mit camp-signalweg PDE IV: camp-spezifisch PDE V: cgmp-stimmulierbar, cgmp spezifisch

28 Struktur PDE V: positive Regulation durch allosterische cgmp-bindung und Phosphorylierung

29 cgmp-abhängige Regulation von Phosphodiesterase Typ V: Negativer Feedback-Loop Sildefanil = VIAGRA

30 Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp - Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp Corpus - Wirkung cavernosum von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

31 Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp - Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp - Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

32 Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp - Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung Wirkung von VIAGRA bei der errectilen Dysfunction: Relaxierung glatter Muskelzellen und Errektion sexuelle Erregung Ca 2+ NO cgmp - Wirkung von VIAGRA: Verhinderung der cgmp-hydrolyse durch Inhibition von PDE5: andauernde Muskel-Relaxierung

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