Testsysteme zur Bestimmung der Aktivität verschiedener Enzyme

Transkript

1 Testsysteme zur Bestimmung der Aktivität verschiedener Enzyme Einleitung: Das Ziel der Versuche ist es, Enzymaktivitäten verschiedener Stoffwechselwege in Geweben zu messen und dadurch Rückschlüsse auf die Art des Stoffwechsels und deren Kapazität machen zu können. Bei den Geweben handelt es sich um Gehirn, Skelettmuskel, Leber und Herz der Maus. Auch die Untersuchung von Bienensperma wird durchgeführt. Für die Messung der Maximalaktivitäten auf einzelne Enzyme werden verschiedene Testsysteme (vgl. Skript) angewandt. Die Aktivitäten der Enzyme werden durch Photometrie bestimmt. Wegen der großen Anzahl der Enzyme behandelt jede Gruppe nur drei Enzyme, führt also auch nur drei Testsysteme durch. Unsere Gruppe beschäftigte sich mit der Untersuchung von GAPDH (Glycerinaldehyddehydrogenase), Citratsynthase (CS) und HOADH (ß-Hydroxyacyl CoAdehydrogenase). Die gesamten Beobachtungen konzentrieren sich somit hauptsächlich auf diese Enzyme. In der Diskussion werden aber die gesamten Daten berücksichtigt. Material / Methode / Durchführung: Für die Bestimmung der Aktivität eines Enzyms durch Photometrie benötigt man eine Reaktion, deren Änderung von Edukten zu Produkten eine Änderung der Extinktion mit sich bringt. Dafür werden die zu untersuchenden Reaktionen oft mit Reaktionen gekoppelt, deren Produkte man photometrisch nachweisen kann. Bei den hier verwendeten Testsystemen wird entweder die Zu- bzw. Abnahme der Extinktion von NADH (Absorption bei 340 nm) oder von einem Farbstoff (DTNB-CoA-Komplex), der eine Absorption bei 412nm aufweist, quantitativ festgehalten. Es handelt sich dabei um die Extinktionsänderung pro Zeit ( E / min). Um sicher zustellen, daß das zu untersuchende Enzym der begrenzende Faktor ist und nicht etwa das Hilfsenzym, werden unterschiedliche Konzentrationen des zu untersuchenden Gewebes (und somit des Enzyms) eingesetzt und auf Proportionalität untersucht. Eine vorhandene Proportionalität bestätigt somit die korrekte Funktion des Testsystems. Bei den gemessenen Aktivitäten handelt es sich um Maximalaktivitäten (Ausnahme Cytochromoxidase). Dies wird durch optimale Versuchsbedingungen (ph, Temperatur, Substratkonzentration) sichergestellt. Die Testsysteme sind im Skript auf den Seiten 21, 28 und 30 für die GAPDH, CS und HOADH beschrieben. Auch die eingesetzten Volumina der Stoffe sind dort in tabellarischer Form zu finden. Seite 1 von 6

2 Änderungen in der eingesetzten Menge an Gewebeextrakten fordern ein unterschiedliches Volumen an Wasser, um auf das Gesamtvolumen von 500µl zu kommen. Dies wird bei den unterschiedlichen Versuchansätzen nicht weiter beschrieben werden. Die Ansätze werden direkt in die Küvette gegeben und dann gemessen. Das Hinzufügen der Starter- Reagenz erfolgt erst nach einem sich nicht mehr verändernden Vorlauf. Gegebenfalls auftauchende Extinktionsänderungen von Nebenreaktionen werden von der eigentlich gemessenen Extinktion abgezogen. Die Tests wurden bei einer gleich bleibenden Temperatur von 25 C durchgeführt. Um die generelle Funktion der Testsysteme sicherzustellen, werden vorab alle Enzymtests mit aufgereinigten Enzymen durchgeführt. Im Anschluß daran werden die zu untersuchenden Gewebe eingesetzt. Zur Herstellung der Gewebsextrakte wird eine Maus getötet und die entsprechenden Organe entnommen. Diese werden in Homogenisationspuffer homogenisiert, zentrifugiert und in Pellet und Überstand getrennt den Gruppen zur Verfügung gestellt. Ergebnisse: Die gemachten Beobachtungen finden sich in grafischer Form in den angefügten Schreiberausdrucken. Desweiteren sind die berechneten Werte in der angefügten Tabelle eingetragen. Die Angaben in der Tabelle sind in Substratumsatz (µmol) pro min und g Frischgewicht = U/g FG. Die Werte werden nach der im Skript abgedruckten Formel berechnet (Seite 11): ( E/min * V * H) / (ε λ * d * X) = Substratumsatz in µmol * min -1 * g -1 Citratsynthase (CS) Herz Sediment: delta E / min = 0,09 Küvetteninhalt (V) = 500µl Homogenisationsfaktor = 20 ml / g Extinktionskoeffizient = 13 cm^2 /µmol Schichtdicke = 1 cm Eingesetzte Extraktmenge (X) = 20µl (0,09 * 500µl * 20 ml / g) / (13 cm^2/µmol * 1cm * 20µl) = 3,461 µmol / min / g (1:10 Verdünnung) 34, 61 µmol / min / g Es werden immer Doppelbestimmungen mit unterschiedlicher Enzymkonzentration durchgeführt. Aus den erhaltenen Werten wird dann der Mittelwert gebildet und dieser in die Tabelle eingetragen. Seite 2 von 6

3 U / g FG HK GPase PFK GAP-DH LDH FBPase CS CytOx HOADH G-6-PDH CK Total Total Total Total Total Total Total Total Total Total Gehirn Ü 0,6 1, ,6 51,4 n.n. 8,1 n.n. n.n. 0, , ,1 51,4 n.n. 14,5 5,2 n.n. 0,9 P 6,4 n.n. n.n. 20,5 n.n. n.n. 6,4 5,2 n.n. n.n. 26,5 186,5 Herz Ü 2, ,9 112,5 n.n. 63,6 n.n. 5,1 n.n , ,9 112,5 n.n. 97,6 23 5,1 n.n. P 0,5 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n n.n. n.n Leber Ü 0,5 1,2 3,8 56,7 225,1 9 7,7 n.n. 6 1,4 n.n. 0,5 2,8 3,8 56,7 225,1 9 12,1 18 9,7 1,4 P n.n. 1,6 n.n. n.n. n.n. n.n. 4,4 18 3,7 n.n. n.n. n.n. Skelettmuskel Ü 1, ,1 271,3 323,6 n.n. 5,6 n.n. 1,4 n.n , ,1 327,6 323,6 n.n ,4 n.n. P n.n. n.n. n.n. 56,3 n.n. n.n. 6,4 5 n.n. n.n. 20 (?) Bienensperma Ü 29,8 n.n. 4,5 59,2 8,9 n.n. 6,5 n.n. n.n. n.n n.n. 4,5 107,8 51,7 n.n. P 15,2 n.n. n.n. 48,6 42,8 n.n. 33,9 40,4 5,2 5,2 n.n. n.n. n.n. n.n Tab. 1: Enzymaktivität in U / g Frischgewicht verschiedener Enzyme in unterschiedlichen Extrakten (Arginin Kinase) Seite 3 von 6

4 Diskussion: GAP-DH: Die Aktivität der GAPDH ist im Vergleich zu z.b. PFK sehr hoch. Dies liegt daran, dass die GAP-DH eine Reaktion katalysiert, die nahe am Gleichgewicht gehalten werden muss, damit die Hin- und Rückreaktion möglich ist, während die PFK nur die Hinreaktion katalysiert und Fluxlimitierend wirkt! Dies gilt insbesondere für die Leber, da dort auch Gluconeogenese stattfindet (vgl. FBPase) Die höchsten Werte für die GAP-DH findet man im Skelettmuskel, da dort vorzugsweise Glycogen zu Substrat verstoffwechselt wird. Die geringe Ausbeute an ATP bei der Substratgärung im Vergleich zur oxidativen Phosphorylierung erfordert eine hohe Fluxrate der Glykogenolyse, um eine gleich hohe ATP-Ausbeute zu erreichen. CS: Die Citratsynthase ist ein Enzym des Citratzyklus. Sie katalysiert dort die Bildung von Citrat aus Oxalacetat und Acetyl-CoA. Im Muskel findet man nur geringe Mengen des Enzyms, da es dort nur im Ruhezustand benötigt wird. Da das Herz sehr stark auf die oxidative Phosphorylierung ausgerichtet ist, findet sich dort ein entsprechend hoher Wert an CS. HOADH: Die ß-Hydroxyacyl CoA-dehydrogenase ist ein Enzym des Fettabbaus. Es findet sich bei den untersuchten Organen ausschließlich in Herz, Leber und Skelettmuskel, wobei der Wert in der Leber der höchste ist. Dieses Ergebnis korreliert auch mit den wichtigen Funktionen der Leber im Fettstofwechsel. Das Gehirn besitzt keine Fett abbauenden Enzyme, da die Gefahr sonst zu hoch wäre, dass die Enzyme auch die Membranlipide der Nervenzellen und anderer wichtiger Strukturen angreifen. HK: Die Hexokinase ist das erste Enzym der Glycolyse. In der Leber findet sich ein relativ niedriger Wert, da dort ein anderes Isoenzym vorliegt, das mit unserem Test nicht erfasst wird. Es lassen sich teils hohe Pellet Werte (Gehirn) nachweisen, da die Hexokinase mit der Cytoplasmamembran und der mitochondrialen Membran assoziiert ist. Diese Bindung findet sich aber nicht bei allen Organen. Da der Muskel Glucose nur im Ruhezustand zur Energiegewinnung verwendet, ist der Wert entsprechend niedrig. Seite 4 von 6

5 GPase: Die Glycogenphosphorylase katalysiert den Abbau von Glycogen zu Glucose-1-Phosphat. Da der Skelettmuskel bei Belastung glycogenabhängig arbeitet sind die Werte hier sehr hoch. Damit ist der Muskel dann auch relativ unabhängig von der Blutversorgung, da sich in der Zelle Glycogenspeicher befinden. Bei den Spermien findet man keine GPase Aktivität. Daraus lässt sich schließen, dass die Spermien auf extrazelluläre Kohlenhydrate angewiesen sind. PFK: Die Phosphofructokinase ist ein Enzym der Glycolyse. Sie katalysiert die Reaktion von Fructose-6-Phosphat zu Fructose-1,6-Bisphosphat. Das Enzym findet sich in allen betrachteten Geweben, da es sowohl für den Glycogen- als auch für den Glucosestoffwechsel benötigt wird. Das Herz weist einen hohen PFK Gehalt auf, damit es bei einem auftretenden Sauerstoffmangel ausschließlich aus Kohlenhydraten ATP gewinnen kann. LDH: Die Lactatdehydrogenase katalysiert die Reaktion von Pyruvat zu Laktat und kann damit zur NADH Regeneration genutzt werden. Die Werte für das Enzym liegen relativ hoch, da es sich hier auch um eine Reaktion handelt, die sehr nahe am Gleichgewicht liegt. Die höchste Enzymaktivität findet sich im Muskel, da er auch anaerob Energie gewinnen kann. In der Leber finden sich ebenfalls hohe Werte, da die Leber u.a. das Laktat, das in den Muskeln entsteht, in einer Rückreaktion wieder umsetzen kann. FBPase: Die Fructose-1,6-Bisphosphatase ist ein Enzym der Gluconeogenese. Sie bildet Fructose-6-Phosphat aus Fructose-1,6-Bisphosphat. Aufgrund ihrer Funktion in der Gluconeogenese findet man die FBPase ausschließlich in der Leber. CytOx: Die Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Sie findet sich in allen untersuchten Geweben, besonders in Herz und Leber. Als membranassoziiertes Protein findet sie sich ausschließlich im Pellet. Aufgrund des Versuchsprinzips (Messbereich) kann bei diesem Versuch nicht die Maximalaktivität gemessen werden. Daher kann aus den gemessenen Werten keine klare Aussage getroffen werden. Seite 5 von 6

6 G6PDH: Die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase ist ein Enzym des Pentosephosphat Stoffwechsels. Sie findet sich ausschließlich im Überstand der Extrakte von Leber und Gehirn. Das Enzym wird für alle reduktiven Synthesen benötigt. Dazu zählen die Nucleinsäuresynthesen in der Leber und Lipidsynthesen im Gehirn. Zudem erfüllt das Enzym einen Schutzmechanismus in dem es eine erhöhte Konzentration an oxidierten Molekülen bzw. Radikale unschädlich machen kann. CK: Die Creatinkinase ist Teil eines ATP-regenerierenden Systems. Sie katalysiert die Reaktion von Creatin zu Creatinphosphat. Creatinphosphat und damit auch die CK ist als schneller Energielieferant fast überall vorhanden. In der Leber findet sie sich jedoch nicht. Der Wert im Sklettmuskel muss jedoch weitaus höher liegen. Die untersuchten Enzyme im Bienenspermium lassen schon erste Rückschlüsse auf deren Energiestoffwechsel zu. Somit kann man zusammenfassend sagen, daß die Spermien auf äußere Kohlenhydrate angewiesen sind, da kein Glycogenstoffwechsel stattfindet, weil die dafür benötigten Enzyme nicht vorhanden sind. Die Enzyme der Glycolyse dagegen sind vorhanden. Auch die des Citratzyklus und die der Atmungskette. Somit kann man festhalten, daß die Spermien oxidativ ATP erzeugen können. Auffällig ist, daß viele Enzyme im Sediment gefunden wurden. Die Untersuchungen anderer Spermien unterstützen diese Beobachtung, da die Enzyme dort oft membrangebunden aufzufinden sind. Als Energiequelle scheiden auch Fette aus, da keinerlei HOADH gefunden wurde. Auch findet keinerlei Gluconeogenese statt. Auch fehlen Enzyme des Pentosephosphatzykluses. Somit fehlen jegliche Enzyme von anabolen Stoffwechselwegen. Dies könnte darauf hinweisen, daß die Spermien in der Königin fertig entwickelt vorliegen. Genauere Vermutungen müssen nun durch weitere Untersuchungen folgen und können anhand der Ergbnisse hier noch nicht gemacht werden. Seite 6 von 6