Die Wirkung von Insulin und (-)-Phenylephrin auf ph i# [Na + ] i# [Ca 2+ ] i# [K + ]i und Plasmamembranpotential von Cardiomyocyten adulter Ratten

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1 Die Wirkung von Insulin und (-)-Phenylephrin auf ph i# [Na + ] i# [Ca 2+ ] i# [K + ]i und Plasmamembranpotential von Cardiomyocyten adulter Ratten DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Michaela Kohler-Schütz aus BERLIN Hamburg 1997

2 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG Der cytosolische ph-wert Die Regulation des cytosolischen ph-wertes Protonenanreicherungsprozesse in der Zelle Pufferwirkungen Protonenaustauschmechanismen und H*-ATPasen HCO 3"-abhängige Austauschmechanismen und H*-ATPasen Der Na*/H*-Antiporter in der Plasmamembran Vorkommen und Eigenschaften des Na*/H*-Antiporter Regulation und Stimulation des Na*/H*-Antiporters Veränderungen der [Na*] 4 und [Ca 2 *], durch den Na*/H*-Antiporter "" Effekte von Insulin auf die cytosolischen Ionenkonzentrationen Das Signalsystem des Insulins Der Insulinrezeptor und Insulinbindung Signaltransduktion von Insulin Effekte von Insulin auf den Na*/H*-Antiporter, phi, [Na'li, [Ca 2 ] lf [K*] i und das Plasmamembranpotential Effekte von Insulin auf den Na*/H*-Antiporter und den phj-wert Effekte von Insulin auf die cytosolische Natriumionenkonzentration [Na*] j Effekte von Insulin auf die cytosolische Calciumionenkonzentration [Ca 2 *] t Effekte von Insulin auf die cytosolische Kaliumkonzentration [K*] Effekte von Insulin auf das Plasmamembranpotential 33 2 PROBLEMSTELLUNG : 35 3 MATERIAL UND METHODEN Tierhaltung 37

3 3.2 Isolierung und die Herstellung von Cardiomyocytenmonlayern Cardiomyocyten-Isolierung Zellzählung Vitalitätstest Lichtmikroskopische Untersuchungen und Trypanblaufärbung [Ca 2 *] j-messung nach der Depolarisierung der Plasmamembran der Cardiomyocyten mit KC Herstellung der Cardiomyocytenmonolayer S Fluorimetrische Bestimmungen von cytosolischen lonenkonzentrationen Messung des cytosolischen ph-wertes ph t Messung der [Ca 2 *],, der [Na*] ( und [K*], Messung des Membranpotentials.' Statistische Auswertung Geräte und Chemikalien Geräte Chemikalien 51 4 ERGEBNISSE Charakterisierung der Cardiomyocyten Morphologie und Zellzahlbestimmung Vitalität der Cardiomyocyten Cytosolische ph-wert-messung Spektroskopische Eigenschaften und der ph,-wert unstimulierter Cardiomyocyten Aktivitätsbestimmungen des Na*/H*-Antiporter Zeitverlauf des phj nach der Zugabe von Natriumpropionat Abhängigkeit des Protonennettofluxes J, H1 vom ph, und die Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters Hemmung und Ionenspezifität des Na*/H'-Antiporters Effekte von Insulin auf den ph,-wert Zeitverlauf des Insulineffektes auf den ph,-wert 61

4 Konzentrationsabhängigkeit des Insulineffektes Hemmung und Ionenspezifität des Insulineffektes Aktivierung des Na*/H*-Antiporters durch Insulin Abhängigkeit des Protonennettofluxes J (HI von der Insulinkonzentration Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters unter Insulinwirkung Hemmbarkeit der durch Insulin verursachten Aktivierung des Na*/H*-Antiporters Effekte von (-) -Phenylephrin auf den phi-wert Konzentrationsabhängigkeit des (-)-Phenylephrineffektes Bestimmung der kinetischen Parameter des Na*/H*-Antiporters unter (-)-Phenylephrinwirkung Effekte von Insulin auf die cytosolische '^ freie Natriumionenkonzentration [Na*] i 75 i Zeitverlauf des Insulineffektes auf die [Na*] L Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [Na*] j Effekte von Insulin auf die cytosolische freie Calciumionenkonzentration [Ca 2 *] t Zeitverlauf des Insulineffektes auf die [Ca 2 *] i Konzentrationabhängigkeit des Insulineffektes auf die cytosolische freie [Ca 2 *] i Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [Ca 2 *], Einfluß der extrazellulären [Ca 2 *] auf den Insulineffekt Einfluß von Verapamil und Nifedipin auf den Insulineffekt Einfluß von Ryanodin auf den durch Insulin verursachten Anstieg der [Ca 2 *] j Abhängigkeit des durch Insulin verursachten Anstiegs der [Ca 2 *] i von der extrazellulären [Na*] Einfluß von Amilorid und Ethylisopropylamilorid auf den durch Insulin verursachten Anstieg der [Ca 2 *] i 85

5 Effekt von PKC-Inhibitoren auf den [Ca 2 *]!-Ef f ekt von Insulin Effekte von Insulin auf die cytosolische freie Kaliumionenkonzentration [K*] i Zeitverlauf des Insulineffektes auf die cytosolische freie Kaliumkonzentration [K*] t Hemmbarkeit des Insulineffektes auf die [K*], Bestimmung des Plasmamembranpotentials Beladungsverlauf und Kalibration der Fluoreszenzintensitäten von bis-oxonol Einfluß von Insulin auf das Plasmamembranpotential Hemmbarkeit des Insulineffektes auf das Plasmamembranpotential Abhängigkeit des Insulineffekts auf das Plasmamembranpotential von der extrazellulären [Na*] Wirkung von Glukose auf den Insulineffekt 94 5 DISKUSSION Methodik Cytosolische Ionenkonzentrationen und Aktivität des Na*/H*-Antiporters ph, und kinetische Parameter des Na*/H*-Antiporters in unstimulierten Cardiomyocyten Effekte von Insulin auf den ph!-wert und den Na*/H*- Antiporter Effekte von (-)-Phenylephrin auf den phi-wert und den Na*/H*-Antiporter Die Insulineffekte auf die [Na*h, [Ca 2 *h, [K*] i und das Plasmamembranpotential von Cardiomyocyten ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS 129