Master Biotechnologie 2. Seminar

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1 Master Biotechnologie 2. Seminar Patrick Pilak Production of semi-synthetic Artemisinin Paddon et al Zielsetzung Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand eine alternative Methode zur Herstellung von Artemisinin zu entwickeln, die eine kostengünstige Versorgung mit Artemisinin darstellt. 2 Einleitung 2.1 Malaria Malaria ist eine Infektionskrankheit, die vorwiegend in Entwicklungsländern in tropischen Regionen verbreitet ist. Im Jahr 2012 wurden Tode registriert, die durch Malaria ausgelöst worden sind. Die Krankheit selbst wird durch die Parasiten der Spezies Plasmodium, wie beispielsweise Plasmodium falciparum ausgelöst. Da letzteres eine Resistenz gegen das kostengünstige Antiobiotikum Choroquin entwickelt hat, werden vorwiegend Artemisininkombinationstherapien eingesetzt. Das Prinzip dabei beruht darauf, dass neben einem Derivat von Artemisinin noch ein zusätzliches Medikament verabreicht wird. Diese Vorgehensweise ist zum Einen sehr effektiv und zum Anderen reduziert dies die Behandlungsdauer. Des Weiteren wird die Wahrscheinlichkeit, dass die Parasiten eine Resistenz gegen eines der beiden Medikamente entwickeln, auf ein Minimum reduziert. 2.2 Artemisinin Das Sesquiterpen Artemisinin (Abb.1) wird natürlicherweise durch den Einjährigen Beinfuß Artemisia annua produziert und gilt laut der WHO seit 2002 als first-line Medikament gegen Malaria. Zudem wirkt es gegen den Cytomegalovirus, Herpes simplex und Hepatitis B und C. Beispiele für Derivate von Artemisinin sind Dihydroartemisinin und Artenusat. 1

2 Abbildung 1: Artemisinin 2.3 Versorgung mit Artemsinin Die Probleme der Versorgung der genannten Entwicklungsländer mit Artemisinin sind zahlreich. So dauert es 18 Monate bis eine bestellte Lieferung Artemisinin geliefert wird, da Artemisinin überwiegend über den Anbau der Pflanze artemisia annua erfolgt. Dadurch ist die Versorgung abhängig von der Wetterlage und der allgemeinen Ernte. Zudem macht Artemisinin nur 1% der Trockenmasse der Pflanze aus. Des Weiteren erschwert die Fluktuation des Preises den Bauern die Planung ihres Anbaus. Aus diesen Gründen ist es von essentieller Notwendigkeit, dass eine alternative Quelle zur Herstellung von Artemsinin gefunden wird, die eine gesicherte Versorgung mit kostengünstigem Artemsinin darstellt. 2.4 Biosynthese von Artemisinin Die natürliche Biosynthese von Artemisinin erfolgt dadurch dass Acetyl-CoA zu Farnesyl- Pyrophosphat umgesetzt wird, welches durch die Amorphadiensynthase zu Amorphadien katalysiert wird. Im nächsten Schritt konkurrieren die Reaktionen von Amorphadien zu Artemisininsäure oder Dihydroartemisininsäure miteinander. In der Pflanze reagiert Dihydroartemisininsäure unter Einwirkung von Licht spontan zu Artemisninin (Abb.2). Abbildung 2: Biosynthese von Artemisinin in A. annua 2

3 3 Ergebnisse 3.1 Biosynthese in Hefe In vorangegangenen Arbeiten wurden die Gene, die für die Synthese von Amorphadien in A.annua verantwortlich sind identifiziert und in S. cerevisae heterolog exprimiert. Dabei liegt eine konkurrierende Reaktion von Farnesylpyrophosphat zu Ergosterol oder Amorphadien vor. Da Ergosterol für die Zelle essentiell ist, wurde die Produktion nicht vollständig inhibiert, sondern lediglich reduziert. In der neusten Arbeit wurde der durch Methionin reprimierende Promotor für die Squalen Synthase durch einen CuSO 4 reprimierenden Promotor ausgetauscht, da aus Kostengründen der Einsatz von CuSO 4 günstiger ist (Abbildung 3). Abbildung 3: Biosynthese von Artemisinin in S.cereviae Die Synthese von Amorphadien zu Artemisinsäure erfolgt über zwei Intermediate. Zunächst wird Amorphadien durch das Cytochrom CYP71AV1 bei vorhandener Reduktase CPR und CYPB5 zu Artemisinalkohol. Im nächsten Schritt wird dieser durch die Alkoholdehydrogenase ADH1 zu Artemisinaldehyd umgesetzt. Im letzten Schritt katalysiert die Artemisininaldehyd Dehydrogenase Artemisinaldehyd zu Artemisnin (Abbildung 4). Die Produktion von Artemisinin erfolgt halbsynthetisch, da zunächst Artemisininsäure biotechnologisch hergestellt wird, welches im Anschluss chemisch zu Artemsinin umgesetzt wird. 3

4 Abbildung 4: Biosynthese von Amorphadien zu Artemisininsäure 3.2 Biosynthese von Artemisinsäure in Schüttelkolben Der Ausgangsstamm Y285 dieser Arbeit liefert einen maximalen Titer von 0,3g/l Artemisininsäure. Durch den Einsatz des CuSO 4 reprimierten Promotors verändert sich dieser Wert nur minimal. Im nächsten Schritt wurde die CPR1 niedriger exprimiert, was den natürlichen Verhältnissen in A. annua entspricht, aber im Stamm Y657 einen niedrigeren Titer zur Folge hat. Der Titer wird jedoch im Stamm Y692 erhöht indem das Cytochrom B5 zusätzlich exprimiert wird. Dieses Cytochrom interagiert mit CYP71AV1 und steigert dadurch dessen Aktivität. CYP71AV1 ist prinzipiell in der Lage alle Teilschritte der Katalyse von Amorphadien zu Artemisinsäure zu katalysieren, ist jedoch nicht sehr leistungsfähig. Durch die zusätzliche heterologe Expression von ALDH1 und ADH1 wird der Titer von Artemisininsäure auf 0,6 g/l erhöht. 4

5 Abbildung 5: Synthese der Sesquiterpene in Schüttelkolben In den durchgeführten Experimenten wurde beobachtet, dass die Artemisininsäure ausfällt und dadurch die Viabilität der Zellen reduziert. Durch den Einsatz von Isopropylmyristatöl wurde dieser Effekt verhindert, da die Artemisininsäure solubilisiert wird. In den Stämmen Y285, Y301, Y657, Y692 und Y1368 werden vorwiegend die Intermediate extrahiert und dadurch die Gesamtmenge an Sesquiterpenen erhöht. Da CYP76AV1 nicht leistungsfähig genug ist wird der Titer an Artemisininsäure nur leicht erhöht. Dennoch ist der Einsatz von Vorteil, da die Zellviabilität erhöht worden ist. Abbildung 6: Synthese der Sesquiterpene in Schüttelkolben mit Isopropylmyristatöl 3.3 Biosynthese von Artemisinsäure in Fed-Batch Reaktoren Durch den Einsatz von Fed-Batch Reaktoren mit Mixed-Feed Prozessen wurde nach 90 Stunden ein maximaler Titer von 9 g/l an Artemisininsäure detektiert. Wird Isopropylmyristatöl zugesetzt, so erhöht sich dieser Titer auf 14 g/l. Durch einen Feed-Pulse Prozess mit Ethanol wurde in dieser Arbeit ein maximaler Titer von 25 g/l erreicht. Der Feed-Puls beruht darauf, dass Ethanol abhängig von der Sauerstoffkonzentration bzw. des Sauerstoffverbrauchs der Zellen schubweise zugesetzt wird. Ethanol dient in diesem Prozess als Precursor für Acetyl-CoA. 5

6 Abbildung 6: Synthese der Sesquiterpene in Fed-Batch Reaktoren 4 Diskussion Neben den biotechnologischen Ansätzen wurde auch die chemische Synthese von Artemisinsäure zu Artemisinin verbessert. Durch den Einsatz von anderen und vor allem kostengünstigeren Substanzen konnte der Ertrag gesteigert und gleichzeitig die Kosten reduziert werden. Durch die biotechnologischen Ansatzpunkte konnte ein maximaler Titer von Artemisininsäure von 25 g/l erreicht werden und die Kosten der Produktion reduziert werden. Diese Arbeit beinhaltet dahingehend den Einsatz von Genetic Engineering, Fermentation und Synthetischer Chemie. Zudem ist die halb-synthetische Herstellung unabhängig von Wetter- und allgemeinen Erntebedingungen. 5 Zusammenfassung Die in dieser Arbeit postulierte Methode beschreibt einen biotechnologischen Prozess zur Herstellung von Artemisinin. Dies würde eine Alternative zur bisherigen Gewinnung von Artemisinin aus dem Einjährigen Beinfuß A. annua darstellen. Aufgrund von wirtschaftlichen Interessen ist dies ein Forschungsfeld, das es weiter zu untersuchen gilt. Zudem ist die halb-synthetische Herstellung unabhängig von Wetter- und allgemeinen Erntebedingungen. Durch den kontinuierlichen Willen die Produktionskosten zu senken, konnte eine alternative Quelle geschaffen werden, die es vor allem ärmeren Entwicklungsländern ermöglicht die Bevölkerung weitreichend mit kostengünstigem Artemisinin zu versorgen, um die Verbreitung von Malaria zu bekämpfen. 6

7 6 Literatur High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin Paddon et al 2013, Nature Semi-synthetic artemisinin a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development Paddon et al 2014, Nature Recent Advances in Artemisinin Production Through Heterologous Expression Arsenault et al