II. GENOMIK: GLEICHZEITIGE UNTERSUCHUNG VON MEHREREN MAKROMOLEKÜLEN

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1 II. GENOMIK: GLEICHZEITIGE UNTERSUCHUNG VON MEHREREN MAKROMOLEKÜLEN

2 Strukturelle Genomik Genomische Bibliothek, EST Datenbank DNA-Sequenzierung Genomprogramme Polymorphismen RFLP

3 Herstellung einer DNA-Bibliothek Humangenom 1. Verdauung mit REs menschliche doppelsträngige (ds) DNA Millionen genomischer DNA-Fragmente Insertion der DNA- Fragmente in Plasmidmoleküle Transformation von Bakterien Genbibliothek Rekombinante DNA- Moleküle

4 Herstellung einer Genomischen Bibliothek 2. 1.: Verdauung mit Restriktionsendonuklease 2.: Ligation in einen Plasmidvektor

5 2 5 Herstellung einer Genomischen Bibliothek 3. 2.: Ligation in einen Plasmidvektor 3.: Transformation von Escherichia coli

6 Genomische Bibliotheken 4. Genomische Bibliothek: Klonsammlung mit allen Fragmenten vom Genom eines gegebenen Organismus (Genomprojekte) Anwendung: Sequenzierung, Isolierung von Genen cdna-bibliothek: enthält die DNA-Kopien aller mrna-moleküle von einem Organismus. Anwendung: Bestimmung der Genstruktur, Isolierung von cdnas (intronfreie Gene), repräsentiert das Transkriptom EST-Bibliothek: expressed sequence tag, repräsentiert das Transkriptom, enthält aber nur das eine Ende (5 oder 3 ) der cdnas Anwendung: für die schnelle Bestimmung des Transkriptoms von einem Zelltyp oder Gewebetyp (Welche Gene in der Zelle/Gewebe exprimiert werden?). Wurde auch für die schnelle Sequenzierung des aktiven Genoms benutzt.

7 Herstellung einer cdna-bibliothek 5. Wie können wir cdna herstellen? mrna cdna 5 CCCCC 5 Zweiter cdna 3 GGGGG 3 erster Strang Strang AAAAAAAAA 3 TTTTTTTTT 5 1. Isolierung von RNA (mrna): gesamt-rna oder mrna-präparat 2. Reverse Transkription: der erste Strang der cdna wird mit Hilfe von oligo dt Primer und Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) hergestellt 3. RNase-Behandlung 4. Linkersynthese: oligo G Linker wird synthetisiert mit terminaler desoxinukleotidyl Transferase (DNA-Polymerase, was kein Templat benötigt) 5. Synthese des zweiten Stranges: der zweite Strang der cdna wird mit Hilfe von oligo dc Primer und DNA-Polymerase hergestellt

8 DNA-Sequenzierung: die Sanger Methode 6. v Dideoxy-Nukleotid-Methode v Stop-Nukleotid-Methode v Kettenterminations-Methode KANN AUTOMATISIERT WERDEN

9 DNA-Sequenzierung die Sanger-Methode 7. (A) Beginn der Synthese des DNA-Stranges (B) Didesoxynukleotid DNA-Template Base (D) Ergebniss des Autoradiogrammes (C) Wenn ein ddntp (hier ddatp) eingebaut wird, die Synthese des Stranges wird angehalten DNA-Sequenz

10 DNA-Sequenzierung die Sanger-Methode 8. Template Primer Sequenz komplementär mit der DNA- Template

11 Automatisierte DNA-Sequenzierung mit fluoreszenten ddntps 9 9. ddntps, jeder Typ mit fluoreszenten Farbstoffen anderer Farbe markiert Sequenzierungsreaktion, Fraktionen der Produkte Imaging-System Detektor

12 Humangenomprojekt 10.

13 Die Methoden 11. Hierarchische Methode Chromosomen (HGP) vs. Shotgun Sequenzierung (Celera) Herstellung von groβen BAC-Klonen, Sequenzierung ihrer Enden Zerschneiden des ganzen Genoms und sofortige Sequenzierung Zerschneiden von BAC- Klonen, Subklonierung

14 Wem gehört das sequenzierte Genom? Ergebnis des Humangenomprojekts: rohe Sequenz des haploiden Humangenoms Etnisch diverse Gruppe von 50 Frauen und Männer (HGP) 8 Männer vom unbekannten Etnikum Etnisch diverse Gruppe von 21 Frauen und Männer (Celera) 2 Männer, 3 Frauen; 1-1 Asiater, Afrikaner, Latin- Amerikaner, 2 Kaukaser 2003: Das erste komplette Humangenom 2006: Ergänzung des kompletten Humangenoms mit Chromosm : Die ersten zwei diploiden Humangenoms (Venter & Watson) 2008: Diploide Genome von einem Han-Chineser und einem Yoruba-Nigerianer Mann

15 Genomprojekte 13. HapMap Projekt Kartierung der SNPs 1000 Genom Projekt Vergleich der genetischen Variabilität von 1000 Menschen

16 Polymorphismen/molekulare Markers im Humangenom 14. Polymorphismen Grundsequenz (bp) Gröβe (bp) SNP 1 1 Single Nucleotide Polymorphisms STR: Mikrosatellit Short Tandem Repeat VNTR: Minisatellit Variable Number of Tandem Repeats RFLP - - Restriction Fragment Length Polymorphism Polymorhismus: Mehrförmigkeit (griechisch) Polymorphes DNA-Locus: wo in einer Population zwei oder mehrere Allele vorkommen

17 VNTR und STR Analyse Amplifikation mit PCR Die PCR-Primer sind komplementär zu den Sequenzen die direkt in der Nachbarschaft des Repeats sind Die Länge des PCR-Produktes ist abhängig: - von der Länge der repetitiven Einheit - von der Kopienzahl VNTRs: 4 Paare homologer Chromosomen von 3 Menschen 2 Wiederholungen 3 Wiederholungen 4 Wiederholungen 5 Wiederholungen

18 VNTR und STR Analyse Gelelektrophorese 16. Die Kopienzahl kann an Hand der Länge der Wiederholung und der Länge des PCR-Produktes bestimmt werden Wir bekommen einen Muster charakteristisch auf den gegebenen Menschen Mutter Vater Töchter Söhne Vaterschaftstest, Personenidentifizierung DNA-Fingerabdruck Sensitive Technik: kann an Hand eines einzigen Haarwurzels oder Bluttropfes realisiert werden

19 SNPs 17. Austausch/Veränderung von einem einzigen Nukleotid (A, T, G oder C) im Genom ACGGCTAA ATGGCTAA Eine Variation ist ein SNP, wenn in der gegebenen Position alle Allele mit einer Wahrscheinlichkeit von mindestens 1% in der Population vorkommen. SNPs sind in 66,6% der Fällen C T Veränderungen.

20 Untersuchung von SNPs: ASA (Allelspezifische Amplifikation) 18. Elektrophorese Genotyp: Homozygot, normal Genotyp: Heterozygot Genotyp: Homozygot, polymorph Gröβe 3 STOP

21 Untersuchung von SNPs: ASA 18. Allelspezifische Amplifikation (ASA) C-spezifische Reaktion T-spezifische Reaktion C/T C/T P 2 C-spez. P 2 P 2 T-spez. P 2 Ergebnisse der Elektrophorese C-spez. T-spez. C-spez. T-spez. C-spez. T-spez. Reaktion Homozygot (C/C) Heterozygot (C/T) Homozygot (T/T) gro es Fragment Allelspez. Fragment

22 19. Restriction Fragment Length Polymorphism Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus Polymorphe Region, wo das Enzym R schneidet (Genotyp AA) oder nicht (Genotyp aa) Restriktionskarte Restriktionsverdauung nach der PCR PCR-Primers Agarose Gelelektrophorese Keine Schnitt Schnitt Schnitt Wenn ein Basenaustausch zur Entstehung oder Zerstörung einer Erkennungsstelle führt, dann verändert sich der Restriktionsmuster: wenn wir die mit PCR amplifizierten Fragmente verdauen, der Genotyp kann an Hand der Anzahl und Gröβe der Fragmente bestimmt werden.

23 20. Palindrom-sequenz Vererbung von RFLP-Markern Eltern Kinder Genotypen

24 Funktionelle Genomik 21.

25 Die Chip-Technologie (Microarray) Sequenzbestimmung - Aufklärung von Mutationen - Einzelnukleotidpolymorhismen (SNP) - Deletion und Insertion - Methylationsmuster DNA-Chips CYTOPLASMA TRANSKRIPTOM - Veränderung der Genexpression - Detektion von Splice-Varianten - Detektion von regulatorischen RNAs (mirna) Transkription ZELLKERN Translation mrna prä-mrna Protein Ribosom trna Protein-Chips PROTEOM - Expression - Modifikationen - Wechselwirkungen

26 DNA-Chip Basis: DNA-DNA oder DNA-RNA Hybridisierung - Dient für die gleichzeitige Bestimmung des Expressionsmusters von vielen Genen. - Ein Chip ist geeignet für die Untersuchung von Genen. - cdna-chips - Oligonukleotid Chips Auf dem DNA-Chip können wir die Aktivität von mehreren tausenden Genen folgen. Jeder Rasterpunkt enthält eine Sequenz charakteristisch für ein bestimmtes Gen. Die aus der biologischen Probe isolierte, fluoreszent markierte RNA gibt ein Fluoreszenzsignal, das mit der Aktivität des Gens proportional ist.

27 1. Fertigung des Chips - Printing Kontrolle 2. Sammlung von Gewebeproben Kranke RNA-Isolierung 4. Reverse Transkription (fluoreszente Markierung) 5. Hybridisierung 6. Detektion

28 Microarray-Analyse - Zusammenfassung RNA-Isolierung cdna-synthese Probe 4. Datenanalyse 2. Hybridisierung von markierten Proben und dem Microarray 3. Scanning

29 (Chromatin-Immunopräzipitation) 26. Antikörper bindet den spezifischen Transkriptionsfaktor Mit Formaldehyd behandelte Zellen, Isolierung von DNA- Fragmenten mittels Ultraschall (Sonikation) Reinigung mit Antikörpern Sammeln des Chromatin/Antikörperkomplexes DNA-Isolierung Bindungen zwischen den Fragmenten und Transkriptionsfaktoren DNA-Sequenz mit der Bindestelle für den Transkriptionsfaktor

30 Die ChIP-chip Technik 1. Laboratoriumphase Genomische DNA Matrix Antikörper Bindung & Bruch Immunpräzipitation Das untersuchte Protein (protein of interest - POI) Reinigung Amplifikation, Markierung Hybridisierung Fluoreszenter Marker

31 Die ChIP-chip Technik 2. In silico Phase Ablesen Auswertung POI Bindungsstellen DNA-Stellen

32 Die ChIP-seq Technik ChIP szekvenálás (ChIP-seq) Zellkern Immobilisierung des Proteins, dann Bruch der DNA Proteinspezifischer Antikörper DNA-Sequenzierung, dann Kartierung Immunpräzipitation, dann Reinigung Entfernung des Proteins

33 27. - Basis: Detektion der Fluoreszenz in jedem Zyklus der PCR - Intensität der Fluoreszenz ist mit der Menge des PCR-Produktes proportional - nach der Reaktion ist eine auf Gel basierende Auswertung nicht nötig - Analyse: auf Software basiert

34 28.

35 RT2-PCR Auf reverse Transkription basierte Real-Time PCR Untersuchung der mrna-expression - Schritte: - RNA-Isolierung (gesamt-rna, mrna, aus Zelle, Gewebe) - Reverse Transkription - (RNA cdna) - Real-Time PCR Begriffe - Real-Time PCR = qpcr (quantitative PCR) - RT2-PCR = qrt-pcr - RT-PCR = PCR nach reverser Transkription

36 Praktische Anwendung von Real-Time PCR SNP-Detektion - - Allelspezifische Real-Time PCR mit TaqMan Sonde - das 3 Ende von dem einen Primer muss beim SNP sein - die DNA-Synthese, also die PCR funktioniert nur, wenn das 3 Ende des angewandten Primers mit dem SNP komplementär ist In diesem Fall man kann die Fluoreszenz des Reporters detektieren

37 Flureszenz Praktische Anwendung von Real-Time PCR Expressionsanalyse - - behandelt unbehandelt - gesund krank - sensitiver als DNA-Chips - gleichzeitige Analyse von Tumor wenigeren Proben - Bestimmung der relativen Kopienzahl: Ct gesund Zykluszahl