Modifizierte Gene Editor Mutagenese

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1 Modifizierte Gene Editor Mutagenese zur gleichzeitigen Einführung mehrerer Punktmutationen DNA Template Präparation: 2 µg Plasmid DNA (bei 6 kb, sonst entsprechend mehr oder weniger) + 2 µl 2M NaOH, 2 mm EDTA (frisch hergestellt!) with H 2 O ad 20 µl 5 Min bei Raumtemperatur (RT) + 2 µl 2M Ammonniumacetat, ph 4,6 mischen, dann sofort zugeben: + 70 µl 100% Ethanol mischen 30 Min, -80 C Zentrifugieren: 30 Min, g, 4 C; Orientierung merken allen Überstand ab; von der Seite, wo DNA nicht hinzentrifugiert wurde (Präzipitat nicht sichtbar) µl 70% Ethanol (-20 C) Zentrifugieren: 5 Min, g, 4 C; gleiche Orientierung allen Überstand ab; von der Seite, wo DNA nicht hinzentrifugiert wurde offen bei 37 C trocknen, bis kein Ethanol mehr riechbar (in dieser Form bei -20 C lagerbar) Phosphorylierung der Mutagenese-Oligos: 1 µl Oligo (100 pmol/µl = 100 µm) 2.5 µl 10xPNK-Puffer 2.5 µl 10 mm ATP 17.5 µl H 2 O 1.5 µl T4-Polynukleotid-Kinase (T4-PNK) mischen

2 30 Min, 37 C 10 Min, 70 C + 25 µl H 2 0, so dass Endkonzentration von Oligo 2 pmol/µl ist Für Hybridisierung und Mutagenese in PCR-tubes auf Eis pro Reaktion vorlegen: 0.75 µl phosph. Mutagenese-Oligo (2 pmol/µl); können theoretisch beliebig viele sein, dürfen aber nicht überlappen + 1 µl phosph. Selektionsoligo (0.25 pmol/µl; i.d.r. bereits vorhanden); bottom or top, so dass Mutagenese- und Selektions-Oligos an gleichen Strang hybridisieren + 2 µl 10xPfu-Puffer mit H 2 O ad 10 µl PCR Maschine programmieren: 5 Min, 75 C langsam auf 55 C abkühlen (ca C pro Sek) 5 Min, 55 C langsam auf 65 C aufheizen (ca C pro Sek) 30 Min auf 65 C halten dann 4 C (Deckel: 105 C) Programm starten und auf Pause drücken erst dann: denaturierte template-plasmid-dna in 100 µl TE aufnehmen (ca. 30 Sek auf- und abpipettieren; mit der Spitze da kratzen, wo DNApellet sein müsste); auf Eis stellen; Denaturierung kann im Agarosegel durch Vergleich mit nicht-denaturiertem Plasmid überprüft werden; + 10 µl denaturiertes Plasmid zu Mutagenese-Ansatz geben; sofort in PCR Maschine stellen und Progamm (s.o.) starten wenn 55 C erreicht sind:

3 + je 10 µl von folgendem Prämix (in PCR-tube ansetzen) zugeben: 3.5 µl H µl dntps (2 mm each) 1 µl NAD + (30 mm; neutralized with Tris Base) 1 µl 10x Pfu-Puffer 1 µl Taq-Ligase (NEB, M0208S, 40 U/µl) 0.5 µl Pfu-Turbo, Phusion o.ä. (Enzyme zuletzt zugeben; gut mischen; Prämix durch Stellen in PCR- Maschine kurz auf 55 C vorärmen; mischen ohne Ansätze aus der PCR- Maschine zu nehmen) Ansätze können nach Beenden des Programmes bei 20 C gelagert werden Transformation der BMH muts Zellen: in kleine, eisgekühlte Glasröhrchen auf mit Stift markierte Stelle pro Mutageneseansatz vorlegen: 0.5 µl bzw. 3 µl Mutagenese-Reaktion + je 50 µl kompetente Zellen auf das Tröpfchen Mutagenese-Reaktion geben und mischen 10 Min auf Eis inkubieren 45 Sek, 42 C Hitzeschock 2 Min auf Eis inkubieren µl SOC Medium 60 Min bei 37 C schütteln + je 3.5 ml LB + 20 µl gene editor -Antibiotikum zugeben (Prämix von Beidem machen) mischen und je 2 ml auf grosse Glasröhrchen verteilen

4 zu je einem der Kulturröhrchen zusätzlich 20 µl gene editor - Antibiotikum geben (pro Mutageneseansatz hat man jetzt 4 Kulturröhrchen) über Nacht (ün) bei 37 C schütteln Transformation von DH5α von je einem der 4 Kulturen eine Plasmid-Minipräp machen, und zwar bei Wachstum in allen Ansätzen mit folgender Priorität: wenig Mutagenese-Reaktion + viel gene editor > wenig Mutagenese-Reaktion + wenig gene editor > viel Mutagenese-Reaktion + viel gene editor > viel Mutagenese-Reaktion + wenig gene editor Plasmidkonzentration bestimmen je 1 und 10 ng Plasmid-DNA (Plasmid-Präps. auf 2 ng/µl in H 2 O verdünnen) ganz normal in je 20 µl kompetente DH5α oder XL1blue transformieren alles auf LB/Amp/ gene editor -Platten (spätestens am Tag vorher giessen) ausplattieren LB/Amp/ gene editor -Platten; pro 1 l Flasche: + 10 g Trypton + 5 g Hefeextract + 5 g NaCl + 15 g Agar + Rührfisch + 1 l H 2 O autoklavieren in grossem Plastikbecher mit kaltem Wasser unter Rühren auf handwarm abkühlen + 1 ml 100 mg/ml Amp

5 + 7.5 ml gene editor mischen durch Rühren (Blasen vermeiden) mit 50 ml Plastikpipette je 20 ml in 10 cm Petrischalen geben (Blasen vermeiden; keine teuren Zellkulturschalen verwenden) in Tüten mit Datum versehen bei 4 C lagern Platten vor Gebrauch offen in einer Sterilbank trocknen je 2 12 Klone picken und animpfen in 2.5 ml LB 2.5 µl 100 mg/ml Amp 15 µl gene editor (Prämix von allen Dreien machen) Plasmid-Minipräp machen und Erfolg der Mutagenese durch Restriktionsanalyze (falls Schnittstellen erzeugt oder zerstört wurden) oder Sequenzierung bestätigen möglichst kleines, die Mutation(en) enthaltenes Fragment in Ausgangsvektor zurückklonieren; diesen Schritt auch durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigen