Versuch von Beadle und Tatum Verändertes Gen -> veränderter Phänotyp

Transkript

1 Versuch von Beadle und Tatum Verändertes Gen -> veränderter Phänotyp Neurospora crassa Ein-Gen-ein-Enzym Hypothese Ein-Gen-ein-Polypeptid-Hypothese Ein-Gen-ein-Genprodukt-Hypothese Purves et al

2 Das zentral Dogma: Von der DNA zum Protein Replikation Transkription Translation Purves et al

3 Genexpression: Gen Abschnitt auf der DNA, der für ein Genprodukt kodiert, inkl. Kontrollregionen Expression Fluss von der genetischen Information (DNA) zum Genprodukt beteiligte Vorgänge sind: Transkription (DNA in RNA) Translation (RNA in Protein) findet in allen lebenden Zellen statt RNA Protein 3

4 Bei Prokaryoten in einem Kompartiment Purves et al Purves et al

5 Pro- und eukaryotische Genexpression DNA Nicht-Matrizenstrang (+) Matrizenstrang, codogen (-) RNA Transkription des Matrizenstranges Translation Protein 5

6 Transkription Purves et al

7 Die chemische Struktur der RNA RNA DNA RNA enthält den Zucker Ribose RNA enthält Uracil anstelle von Thymin 7

8 Die RNA-Polymerase transkribiert DNA RNA-Polymerase aus E. coli DNA-abhängige RNA-Polymerase Katalyse von Phosphatdiesterbindungen Verlängerung der wachsenden RNA Kette in 5 ->3 Richtung Substrat: Ribonukleosidtriphosphate, kein Primer α α σ β β Minimal (Core) Enzym, 4 UE: α 2,β,β Holoenzym, 5 UE: α 2,β,β,σ α: Struktur des Enzyms σ: Erkennung β: RNA-Synthese des Transkriptionsstarts β : Bindung an DNA 8

9 Promotor: Erkennungs- und Startpunkt für die RNA-Polymerase -35 -Region upstream -Bereich -10 -Region -1 keine 0 +1 Start der Transkription ATG nicht-transkribierte DNA transkribierte DNA Start der Translation Konsensussequenzen prokaryotischer Promotoren -10-Region = Pribnow-Box -35-Region lac ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAA trp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA pl TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT Kons.-S TTGACA---17+/-1 bp-----tataat

10 Transkriptionszyklus einer bakteriellen RNA-Polymerase RNA σ-faktor Promotor Haarnadel RNA-Polymerase DNA 1. Bindung des RNA-Pol-Holoenzyms an den Promotor (geschlossener Komplex) 7. Freisetzung des Transkripts 6. Termination 2. Aufwinden der DNA (offener Komplex) 5. Elongationsphase mit hoher Prozessivität (50 nt/s) 3. Anfängliche Transkription (10 nt) Ribonukleosidtriphosphate RNA RNA 4. Ablösung des σ-faktors 10

11 Alternative Sigmafaktoren: Regulation der Genexpression bei E. coli Sigmafaktor Größe (kda) Funktion σ Standard-Sigmafaktor σ S 38 Hunger, Stress σ Hitzeschock 11

12 Transkriptionstermination bei E. coli Rho-unabhängige Termination Rho-abhängige Termination Haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3 Nichtkodierungsbereich einer mrna Rho-Protein (Hexamer) lagert sich an mrna spaltet ATP 12

13 Transkripte sind länger als die kodierende Region Promotor +1 Ende Terminator DNA Kodierende Region 5 3 RNA-Transkript Leadersequenz 5 untranslatierter Bereich Trailer-Abschnitt 3 untranslatierter Bereich 13

14 Prokaryot Eukaryot RNA-Polymerase polycistronische mrna RNA-Polymerase Cap-Struktur monocistronische mrna Poly(A)-Schwanz Kernpore Translation noch während der Transkription mrna muss aus dem Kern ausgeschleust werden 14

15 Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen Brown

16 Eukaryoten: drei DNA-abhängige RNA-Polymerasen im Kern RNA-Polymerase Produkt Lokalisierung RNA-Pol I: rrna (28S, 18S, 5,8S) Nukleolus RNA-Pol II: mrna (Protein-kodierende Gene) Nukleoplasma snornas, einige snrnas RNA-Pol III: 5S rrna, trnas, viele snrnas Nukleoplasma interne Promotoren! Zusätzlich RNA-Polymerasen in Mitochondrien und Chloroplasten mt-rna-pol mitochondriale Transkripte Mitochondrien (nur eine UE) (kernkodiert) pt-rna-pol (PEP) plastidäre Transkripte Plastiden (E.coli-ähnlich) (plastidenkodiert) pt-rna-pol (NEP) plastidäre Transkripte Plastiden (nur eine UE) (kernkodiert) 16

17 Eukaryotische Promotoren sind weniger konserviert prokaryotischer Promotor eukaryotischer RNA-Pol II Promotor Jannig & Knust

18 Struktur und Transkription eines eukaryotischen Gens Purves et al

19 Transkription eukaryotischer DNA durch die RNA-Polymerase II benötigt viele allgemeine Transkriptionsfaktoren (TF) TFIIH 19

20 Eukaryotische Gene enthalten kodierende Exon- und nicht-kodierende Intron-Bereiche, eukaryotische RNA-Pol II-Transkripte werden prozessiert 1. Anfügen des Cap am 5 Ende 2. Polyadenylierung am 3 Ende 3. Spleißen Alle drei Prozesse finden im Zellkern statt! 20

21 Capping des Transkriptes am 5 Ende: Anfügen eines modifizierten Guaninnukleotids 5 Cap signalisiert 5 Ende eukaroytischer mrnas Wird während der Transkription Methylgruppe angehängt 5 Cap wichtig für Export der mrna ins Cytosol und die Translation 5-5--Bindung 7-Methyl-Guanosintriphosphat 21

22 Polyadenylierung am 3 -Ende 3 -Poly(A)-Schwanz signalisiert 3 -Ende eukaroytischer mrnas Poly(A)-Polymerase (Polymerisation ohne Matrize!) A-Nukleotide werden angehängt 3 -Poly(A)-Schwanz wichtig für Export der mrna ins Cytosol, für die Stabilität und die Translation Nukleotide < 30 Nukleotide Spaltung durch Endonukleasekomplex wird abgebaut Poly(A)-Anheftung durch Poly(A)-Polymerase 22

23 Spleißen des Transkripts Spleißen = Entfernen der Intronsequenzen aus dem Primärtranskript, Verknüpfung der Exons Nukleotidsequenzen markieren die Spleißstellen Spleißen wird durch Spleißosomen ausgeführt Spleißosomen sind aus Proteinen und snrnas zusammengesetzt Intron wird entfernt Teil der mrna 23 Janning & Knust 14.9

24 Das Spleißosom, eine Spleißmaschine Purves et al

25 Eukaryoten: Kontrolle der Transkription durch die Chromatinstruktur Modifikation (z. B. Acetylierung) der Chromatinproteine (Histone) reguliert die Transkription Nukleosom 10 nm Histonoktamer Histon- Deacetylierung Histon-Deacetylase (HDAC) DNA offenes Chromatin -> transkriptionsaktiv Histon- Acetylierung Histon-Acetyltransferase (HAT) kondensiertes Chromatin -> transkriptionsinaktiv 30 nm 25 Janning & Knust 17.16

26 Histon-Acetyltransferase (HAT) Reguliert Zugänglichkeit der DNA für Proteine der Transkriptionsmaschinerie Histon-Acetyltransferase (HAT) acetyliert Histone in der Nähe der TATA-Box Transkriptionsfaktor RNA-Polymerase II Histone DNA Ac Transkription Nukleosom 26

27 Modifikation des Chromatins Histon- Deacetylierung Histon-Methylierung DNA-Methylierung Histon- Acetylierung Histon-Demethylierung DNA-Demethylierung 27

28 Initiation der Genexpression: Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryoten Prokaryoten Eukaryoten RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase, drei RNA-Polymerasen, einige Sigma-Faktoren viele allgemeine Transkriptionsfaktoren regulatorische Transkriptions- ja ja; zahlreich faktoren Transkript meist polycistronisch, monocistronisch, keine Modifikation Modifikation am 5 - u. 3 -Ende Introns i.d.r. nicht vorhanden, meist vorhanden, kein Spleißen Spleißen Trennung von Transkription u. nein ja (Kern/Cytoplasma) Translation Einfluss der Chromatinstruktur kein Chromatin! ja 28

29 Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen Brown

30 Ribosomale RNA Purves et al Ribosomen bestehen aus RNA (rrna) und Proteinen und sind aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt 30

31 Ribosomen 31

32 Svedbergeinheit S Maß für Sedimentationsgeschwindigkeit bei Zentrifugation in einem Dichtegradienten S-Wert abhängig von Größe, Form, Volumen und Dichte des Partikels/Moleküls je größer und kompakter, desto größer ist Wanderungsgeschwindigkeit Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifigation, Sedimentationsanalyse oder Dichtegradientenzentrifugation (Saccharose) 32

33 Dichten und S-Werte von Zellmaterial 33

34 Zusammensetzung der Ribosomen bei Pro- und Eukaryoten Prokaryoten Eukaryoten Größe rrna Proteine Größe rrna Proteine (Nukleotide) (Nukleotide) große UE 50S 23S rrna (2904) 5S rrna (120) L1, L2, L3, etc. Ges.: >30 60S 28S rrna (4818) 5,8S rrna (160) L1, L2, L3, etc. Ges.: ca. 50 5S rrna (120) kleine UE 30S 16S rrna (1542) S1, S2, S3, etc. Ges.: >20 40S 18S rrna (1874) S1, S2, S3, etc. Ges.: ca

35 Molekulare Feinstruktur eines 70S Ribosoms Purves et al b 35

36 Sekundärstruktur der 16 S rrna von E. coli 36

37 Prozessierung der eukaryotischen rrna Janning & Knust 15.1e 37

38 DNA, die rrna kodiert ist repetitiv Purves et al

39 Nukleolus Kernkompartiment Ort der rrna Synthese Nukleolus besteht aus DNA, RNA und Proteinen Prozessierung der prä-rrna, Zusammensetzung präribosomaler Partikel Nukleolus-Organisator (NO) besteht aus rdna, die von mehreren Chromosomen stammen kann und tandemartig abgeordnete rdna enthält 39

40 trnas fungieren als Adapter ( trna Moleküle pro Bakterien-Zelle) 40

41 trnas bestehen aus Nukleotiden Kleeblattstruktur Akzeptorarm bindet Aminosäure; 3 Ende endet immer auf -CCA DHU-Arm enthält ungewöhnliches Pyrimidin Dihydrouracil Anticodonarm erkennt mrna Variabler Arm enthält variable Anzahl an Nukleotiden TψC enthält die Abfolge T, Pseudouracil und C 41

42 Tertiärstruktur der trna jede trna hat individuelle 3D-Struktur 42

43 Uridin Zucker 43

44 Der genetische Code 44

45 Die 20 in Proteinen vorkommenden Aminosäuren Janning & Knust

46 Problem: 4 Buchstaben A,T,G,C -> aber 20 Aminosäuren Singulet-Code: 4 Codons Duplett-Code: 4 2 = 16 Codons Triplett-Code: 4 3 = 64 Codons Purves et al

47 Frage: Welches Triplett codiert für welche Aminosäure? Versuch von Nirenberg und Matthaei Purves et al

48 Der Code ist degeneriert, d.h. mehrere Tripletts codieren eine Aminosäure (Ausnahme: Tryptophan und Methionin) Synonyme Codons sind sich meist ähnlich, so dass die ersten beiden Basen eines Tripletts oft schon die Aminosäure spezifizieren (Ausnahmen: Leucin und Arginin) Leucin Leucin Arginin Arginin Purves et al

49 Die "Wobble"-Hypothese (F. Crick 1965) "wobble" = "Schwanken, Wackeln" Eine einzelne z. B. mit Glycin beladene trna kann drei verschiedene Codons auf der mrna erkennen 49

50 "Wobble" Abweichungen bei der Bindung des Anticodons an das Codon 50

51 Der genetische Code ist fast universell und gilt für alle Organismen Es gibt wenige Ausnahmen (insbesondere in Mitochondrien- Genomen) z.b. UGA (normalerweise Stop) in Mitochondrien Tryptophan und AUA (normalerweise Isoleucin) in Mitochondrien Methionin 51

52 Verwendung von Code-Wörtern (Codon usage) Ein Beispiel: 6 Arginin Codons CGT 43% CGC 32% CGA 7% CGG 8% AGA 9% AGG 1% korrespondiert mit Vorkommen synonymer trnas d.h. es gibt seltene Codons (Speziesspezifisch) Regulation von Genaktivität, da seltene Codons zu schwächerer Expression führen 52