Entwicklung eines injizierbaren Zell- Matrix-Komposites zur Regeneration der Bandscheibe (Nucleus pulposus)
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- Gerhardt Graf
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1 Entwicklung eines injizierbaren Zell- Matrix-Komposites zur Regeneration der Bandscheibe (Nucleus pulposus) Einfluss verschiedener Stimuli auf die Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen in Richtung Nucleus pulposus-zellen Dissertation zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften Dr. rer. nat. des Fachbereiches Biologie und Chemie der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Franziska Ehlicke aus Karl-Marx-Stadt (jetzt Chemnitz) Gießen, August 2013
2 Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von Januar 2009 bis August 2012 am Institut für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie der Technischen Hochschule Mittelhessen im Rahmen des LOEWE-Schwerpunktes BioIM Bioengineering & Imaging durchgeführt. Dekan: Prof. Dr. Holger Zorn 1. Gutachter: Prof. Dr. Peter Czermak 2. Gutachter: Prof. Dr. Adriaan Dorresteijn Tag der mündlichen Prüfung:
3 Schriftenreihe des Institutes für Bioverfahrenstechnik und Pharmazeutische Technologie Band 1 Franziska Ehlicke Entwicklung eines injizierbaren Zell-Matrix- Komposites zur Regeneration der Bandscheibe (Nucleus pulposus) Einfluss verschiedener Stimuli auf die Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen in Richtung Nucleus pulposus-zellen Nucleus pulposus kursiv D 26 (Diss. Universität Giessen) Shaker Verlag Aachen 2014
4 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2013 Diese Veröffentlichung ist Teil meiner Promotion zum Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) durch den Fachbereich Biologie und Chemie (FB 08) der Justus-Liebig-Universität Gießen, Deutschland. Copyright Shaker Verlag 2014 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de
5 Publikationen Veröffentlichungen Publikationen Freimark, D., F. Ehlicke, P. Czermak (2010). "The need for imaging methods in bioengineering of three-dimensional cell cultures." Int J Artif Organs 33(4): DOI: /IJAO Ehlicke, F., D. Freimark, B. Heil, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010). "Intervertebral disc regeneration: influence of growth factors on differentiation of human mesenchymal stem cells (hmsc)." Int J Artif Organs 33(4): DOI: /IJAO Ehlicke, F., T. Bergmann, D. Salzig, M. Pudlas, P. Czermak. "Raman spectra classification of biological samples by wavelet data processing." Vib Spectrosc (eingereicht) Abstracts in Fachzeitschriften Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." Int J Artif Organs 33: 7, 441. Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration der Bandscheibe: Einfluss diverser Stimuli auf die Differenzierung von Stammzellen zu Bandscheibenzellen." Chemie Ingenieur Technik 82: 9, 1559 DOI: /cite [Special Issue: ProcessNet-Jahrestagung 2010 und 28. Jahrestagung der Biotechnologen; September, 2010] Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." DOI: /BMT Biomed Tech 55: Suppl. 1. Oct
6 Publikationen Ehlicke, F., D. Freimark, M. Pudlas, A. Dorresteijn, H. Walles, P. Czermak (2011) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." Int J Artif Organs 34:8, 690. DOI: /IJAO Salzig, D., F. Ehlicke, A. Dorresteijn, P. Czermak (2011) "Potential of mesenchymal stem cells for regeneration of intervertebral disc." Biomaterialien 12: 1-4, 198 Freimark, D., F. Ehlicke, A. Dorresteijn, P. Czermak (2011) Regeneration of intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells. Tissue Eng Part A 17:550 DOI: /ten.tea [Meeting abstract für BioStar 2010; 4th Congress on Regenerative Biology and Medicine; October 13 15, 2010; Stuttgart, Germany] Konferenzbeiträge (Vorträge) Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." 3 rd International Congress "Biotechnologies for Spinal Surgery Biospine 3"; September 1-4, 2010, Amsterdam, The Netherlands Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." XXXVII. European Society for Artificial Organs Congress (ESAO 2010); September 8-11, 2010, Skopje, Republic of Macedonia Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration der Bandscheibe unter Verwendung in vitro differenzierter Stammzellen." 44. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biomedizinische Technik (BMT 2010); Oktober 5-8, 2010; Rostock, Deutschland
7 Publikationen Konferenzbeiträge (Poster) Ehlicke, F., D. Freimark, P. Czermak (2009) "Regeneration of Intervertebral Disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells; Influence of cell density and growth factors on differentiation" World Conference on Regenerative Medicine (WCRM 2009); October 29-31, 2009; Leipzig, Germany Ehlicke, F., D. Freimark, B. Heil, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of Intervertebral Disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells; Influence of cell density and growth factors on differentiation." World Forum for Spine Research 2010 The Intervertebral Disc; July 5-8, 2010; Montreal, Canada Ehlicke, F., D. Freimark, B. Heil, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of Intervertebral Disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells; Influence of cell density and growth factors on differentiation." BioStar 2010; 4th Congress on Regenerative Biology and Medicine; October 13 15, 2010; Stuttgart, Germany Ehlicke, F., D. Freimark, B. Heil, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of the Intervertebral Disc (IVD): Influence of various stimuli on the differentiation of stem cells into IVD cells; Influence of growth factors." Dechema Jahrestagung 2010; September 21-23, 2010; Aachen, Deutschland Ehlicke, F., D. Freimark, A. Dorresteijn, P. Czermak (2010) "Regeneration of Intervertebral Disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells; Influence of cell density and growth factors on differentiation." American Chemical Society s 239th National Meeting; Paper 27361; March 21-25, 2010; San Francisco, USA Ehlicke, F., D. Salzig, P. Czermak (2011) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." XXXVIII. Congress of the European Society for Artificial Organs (ESAO 2011) and IV. Biennial Congress of the International Federation on Artificial Organs (IFAO 2011); October 9-12, 2011; Porto, Portugal
8 Publikationen Ehlicke, F., D. Salzig, P. Czermak (2011) "Regeneration of the intervertebral disc (IVD) using in vitro differentiated stem cells." World Conference on Regenerative Medicine (WCRM 2011); November 2-4, 2010; Leipzig, Germany Ehlicke, F., D. Salzig, P. Czermak (2012) "Regeneration Of The Intervertebral Disc (Nucleus pulposus); Influence of Various Stimuli On The Differentiation Of Human Mesenchymal Stem Cells Into The Lineage Of NP Cells." Perspectives in Cell- and Gene-Based Medicines (CGM 2012); March 15-17, 2012; Frankfurt/M., Germany
9 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I Symbole und Abkürzungen... V Zusammenfassung...VII Abstract... IX Einleitung... 1 Die Bandscheibe... 1 Aufbau der Bandscheibe... 2 Degeneration der Bandscheibe... 4 Therapie von Bandscheibendegeneration... 8 Zelltherapie zur Regeneration von degenerierter Bandscheibe / des Nucleus pulposus Charakterisierung humaner Nucleus pulposus-zellen Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen zur NP- Regeneration Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Zellkultur Verwendete Zelllinien und Medien Passagieren und Expansion Bestimmung von Zellzahl, -vitalität und -proliferation Einfrieren und Auftauen von Zellen Zelldifferenzierung Zelldifferenzierung in Agarosehydrogelen Zelldifferenzierung in Gelatinehydrogelen Applikation von möglichen (Re-)Differenzierungsstimuli auf ZMKs Analytische Methoden Immunofluoreszenzfärbung Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Raman-Spektroskopie Molekularbiologische Methoden RNA-Isolierung Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von isolierter RNA I
10 Inhaltsverzeichnis cdna-synthese für Endpunkt-RT-PCR Polymerasekettenreaktion (Endpunkt-RT-PCR) Gelelektrophorese cdna-synthese für quantitative Echtzeit-RT-PCR Quantitative Echtzeit-RT-PCR (qrt-pcr) Ergebnisse und Diskussion Eignung verschiedener Analysemethoden zur Unterscheidung der Primärzellen hnpc und hchon sowie der Zelllinie hmsc-tert Analytik mittels Hellfeld-Mikroskopie Analytik mittels Immunofluoreszenz Analytik mittels Raman-Spektroskopie Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Applikation von Stimuli zur Differenzierung von hmsc-tert in Richtung hnpc Einfluss von Differenzierungsmedium / Nährstoffverfügbarkeit Einfluss von Wachstumsfaktoren Einfluss von Komponenten der extrazellulären Matrix Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) Einfluss von Ultraschall Diskussion zur Differenzierung von hmsc-tert Applikation von Stimuli zur Redifferenzierung von hnpcs Einfluss der Nährstoffverfügbarkeit Einfluss der extrazellulären Matrix Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) Einfluss von Ultraschall Diskussion zur Redifferenzierung von hnpcs Applikation von Stimuli zur Redifferenzierung von hchons Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) Diskussion zur Redifferenzierung von hchons Schlussfolgerung und Ausblick Literaturverzeichnis Danksagung II
11 Inhaltsverzeichnis Anhang A0 Zusätzliche Angaben zur Reinheit isolierter RNA A1 Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Differenzierungsmedium / Nährstoffverfügbarkeit auf die Differenzierung von hmsc-tert A1.1 A1.2 A2 A2.1 A2.2 A2.3 A3 A3.1 A3.2 A4 A4.1 A4.2 A5 A5.1 A5.2 A5.3 A6 A6.1 A6.2 A7 A7.1 A7.2 A8 A8.1 Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Wachstumsfaktoren auf die Differenzierung von hmsc-tert Analytik mittels Immunofluoreszenz Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Komponenten der extrazellulären Matrix auf die Differenzierung von hmsc-tert Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) auf die Differenzierung von hmsc-tert Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Ultraschall auf die Differenzierung von hmsc-tert Analytik mittels Immunofluoreszenz Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Nährstoffverfügbarkeit auf die Redifferenzierung von hnpcs Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss der extrazellulären Matrix auf die Redifferenzierung von hnpcs Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) auf die Redifferenzierung von hnpcs Analytik mittels PCR III
12 Inhaltsverzeichnis A8.2 A9 A9.1 A9.2 A9.3 A10 A10.1 A10.2 Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss von Ultraschall auf die Redifferenzierung von hnpcs Analytik mittels Immunofluoreszenz Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Zusätzliche Analytik zum Einfluss der Stützmatrix (Hydrogel) auf die Redifferenzierung von hchons Analytik mittels PCR Analytik mittels qpcr Lebenslauf IV
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