What is a Fourier transform? A function can be described by a summation of waves with different amplitudes and phases.

Transkript

1 What is a Fourier transform? A function can be described by a summation of waves with different amplitudes and phases.

2 Fourier Synthese/Anaylse einer eckigen periodischen Funktion

3 Fourier Interferomter Fourier Interferomter

4 Fourier Interferomter Fourier Transformation

5 Bestimmung der Molekularen Masse von Makromolekülen Größenausschlußchromatographie Gelfiltration, SEC=size exclusion chromatography

6 Größenausschlußchromatographie Gelfiltration, SEC=size exclusion chromatography BSA log MW [kda] 10 Carboanhydrase Lysozym Aprotinin Elutionsvolumen [ml] Größenausschlußchromatographie Vorteile: Sehr oft ist Gelfiltration ein Schritt bei der Isolation des Proteins. Somit ist die Information über die native Größe schon vorhanden. Genauigkeit: +/- 10% im optimalen Fall bis zu +/-50% Abweichung Nachteile: Das Elutionsvolumen kann durch die Form des Proteins oder auch durch Interaktionen des Proteins mit der Säulenmatrix stark beeinflusst werden. Schwache Komplexe zerfallen auf Gelfiltration. Protein Hydrodynamischer Radius

7 Massenspektrometrie Massenspektrometrie Prinzip: Moleküle werden ionisiert und im elektrischen Feld beschleunigt Hauptmethoden: ESI = Electrospray Ionisation MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

8 Massenspektrometrie Detektion der ionisierten Moleküle z.b. mittels TOF = Time Of Flight Prinzip Alle Moleküle haben nach der Beschleunigung im el. Feld die gleiche kinetische Energie = E = ½ mv 2. Es gilt E kin (Molekül 1) = E kin (Molekül 2) ½ m 1 v 2 1 = ½ m 2 v 2 2 Ist nun die Masse m 1 größer als die Masse m 2 ist also die Geschwindigkeit v 1 entsprechend kleiner als v 2 d.h. das leichtere Molekül 2 kommen zuerst an. Massenspektrometrie Latest: Detektion der ionisierten Moleküle Orbitrap

9 Massenspektrometrie Vorteile: Sehr wenig Probe wird benötigt. Sehr präzise Messungen. Genauigkeit bis +/- 0.1 Da Nachteile: Da die Proteien ionisiert werden müssen, kommt es oft zur Deanturierung der Proteine; d.h. Multimere oder Komplexe zerfallen sehr oft bei der Ionisation und können nicht detektiert werden. Dynamische Lichtstreuung DLS, Dynmaic Light Scattering auch quasielastische Streuung genannt. Grundprinzip: Ist das Molekül sehr viel größer als die Wellenlänge des eintreffende Lichts, werden die Photonen elastisch - d.h. ohne Änderung Wellenlänge - gestreut (Rayleigh Scattering). (Analogie zum elastischen Stoß, bei dem ein Partikel, der sehr viel kleiner als der Stoßpartner ist, zwar eine andere Richtung erhält aber die Geschwindigkeit vollständig erhalten bleibt)

10 Dynamische Lichtstreuung Gestreutes Licht Einfallendes Licht Moleküle in Lösung Moleküle in Bewegung Dynamische Lichtstreuung Einfallendes Laserlicht Auslöschung Detektion Verstärkung

11 Dynamische Lichtstreuung Änderung der Inensität in Abhängigkeit von der Bewegung Einfallendes Laserlicht Auslöschung Verstärkung Dynamische Lichtstreuung Änderung der Lichtintensität gibt Rückssschlüsse auf Bewegung der Moleküle und über den Diffusionskoeffizienten auf die Größe der Moleküe. Brown sche Molekülbewegung abhängig von Diffusionskoeffizient Diffussionskoeffizient k B = Boltzmann Konstante T= Temperatur η = Viskosität R 0 = Hydrodynamischer Radius des diffundierenden Teilchens

12 Dynamische Lichtstreuung Vorteile: Wenig Probenvolumen, in der Regel geringe Proteinkonzentration Benötigte Proteinkonzentration von der Größe des Proteins abhängig. Nachteile: Methode extrem anfällig auf Partikel, wie z.b. aggregiertes Protein,Staub, etc, geringe Präzision. Achtung bei Glycerin oder andere Substanzen im puffer, die Viskosität stark ändern. Analytische Ultrazentrifugation Grundprinzip: Bewegung der Moleküle während Sedimentation oder Sedimentationsgleichgewicht wird gemessen => Rückschlüsse auf Größe.

13 Analytische Ultrazentrifugation Analytische Ultrazentrifugation

14 Analytische Ultrazentrifugation Analytische Ultrazentrifugation t=0 t=x

15 Analytische Ultrazentrifugation Sedimentation Analytische Ultrazentrifugation Lamm Gleichung

16 Analytische Ultrazentrifugation Analytische Ultrazentrifugation

17 Analytische Ultrazentrifugation Die Gestalt des Moleküls kann anhand der anl.uz Daten bestimmt werden Experimentell: Berechnet für ein globuläres Protein Viskosität Viskosität von Wasser Hydratrion/Wasserhülle g H 2 O/ g Protein : (0.3g/g) Avogadro Zahl f/fo axial ratio Analytische Ultrazentrifugation Analyse mit Program Sedfit (Freeware):

18 Analytische Ultrazentrifugation Das Verwenden ALLER Daten erlaubt den nachweis selbst kleiner Mengen an Multimeren; Bsp. BSA, Monomer 61.2 kda, Dimer und Trimer. Analytische Ultrazentrifugation Analyse mit Program Sedfit (Freeware): Fit des f /f 0 Verhältnis in Sedfit implementiert => Abschätzung Molekülgestalt