Fachverlag Köhler Giessen VETERINÄRMEDIZIN
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- Gerburg Althaus
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1 VETERINÄRMEDIZIN Kälteanpassung \bi\ Listeria monocytogenes: Klonierung, D^Ä-Sequenzanalyse und Funktionsstudien der Gene CS/JL, CS/JLB und flar aus dem Wildtypstamm Listeria monocytogenes EGD Eva-Maria Busch Fachverlag Köhler Giessen
2 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG l 2 LITERATURÜBERSICHT Taxonomie von Listeria spp Kälteanpassung von L. monocytogenes Extrazelluläre Beweglichkeit Listeriose bei Mensch und Tier Infektionsverlauf und beteiligte Virulenzfaktoren L.monocytogenes im Mausinfektionsmodell Epidemiologie der Listeriose Diagnostik von L.monocytogenes 22 3 MATERIAL Bakterienstämme Plasmide Oligonukleotide Vorgefertigte Reagenzien Anzuchtmedien Antimikrobielle Wirkstoffe Standardpuffer Chemikalien, Enzyme und Antikörper Molekulargewichtsmarker Peptide Geräte 32 4 METHODEN Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung chromosomaler DNA aus Listerien Isolierung von episomaler DNA 36
3 4.1.3 Isolierung von RNA Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Nukleinsäure-Analytik Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Restriktion von DNA mittels Restriktionsendonukleasen Aufreinigung von Ligations-und Restriktionsansätzen Elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren Transfer von Nukleinsäuren auf eine Membran Hybridisierung Klonierung von DNA-Fragmenten Transformation von episomaler DNA in Bakterien Herstellung chromosomaler Deletionsmutanten DNA-Sequenzanalyse Primer Extension Isolierung von bakteriellen Proteinen Präparation von Überstandsproteinen Präparation von Membranproteinen mittels Harnstoffextraktion Präparation von Zellwand-Proteinen mittels SDS-Extraktion Herstellung von Zytoplasmaextrakten Protein-Analytik SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) Transfer von Proteinen auf eine Membran (Western Blot) Immunologischer Nachweis von Proteinen Naßblot zur N-terminalen Proteinsequenzanalyse Herstellung polyklonaler Antikörper Immunfluoreszenz Fluoreszenzbestimmung Mausinfektionsmodell Anlegen von Glyzerinkulturen Wachstumstests mit L.monocytogenes Motilitätstest von Listerien im Hitchens-Agar Vergleichende Datenbankanalysen 71
4 III 5 ERGEBNISSE Charakterisierung des flar-gens Klonierung des flar-gens DNA-Sequenzanalyse desy?aä-gens Untersuchung zur Spezifität desyzaä-gens bei Listeria spp Funktionsanalysen des flar-gens durch Konstruktion einer EGDv.AflaR- Deletionsmutante Herstellung der EGD::A/7a7?-Deletionsmutante Vergleich der exprimierten Proteine des Wildtyps und der Mutante Motilitätstests Untersuchung der Expression kälteinduzierter Proteine N-terminale Sequenzanalyse von kälteinduzierten Proteinen Charakterisierung des cspl-gens und seiner flankierenden Bereiche Klonierung und DNA-Sequenzanalyse Funktionsanalysen des «pl-gens durch Konstruktion einer EGD::AaypL- Deletionsmutante Konstruktion der EGD::AcipL-Deletionsmutante Charakterisierung der EGD::Ao?pL-Deletionsmutante Herstellung CspL-spezifischer polyklonaler Antikörper Immunbiochemische Untersuchungen mit polyklonalen CspLspezifischen Antikörpern Transkriptionsstudien Transkription des cspl-gens Transkription des./7a4-gens Kartierung des Transkriptionsstartpunktes von cspl durch Primer Extension Promotorsequenz des orpl-gens Ribosomenbindungsstelle Untersuchung der EGD::AcspL-Mutante im Mausinfektionsmodell Funktionsstudien des cspl-gens mit dem Grün fluoreszierenden Protein" Herstellung eines CspL-GfP-Fusionsproteins 118
5 IV Inhaltsverzeichnis Transformation Wachstumsversuche bei unterschiedlichen Temperaturen Immunbiochemische Untersuchungen Analytische und funktionelle Charakterisierung des asplb-gens Nachweis des CspLB-Proteins durch N-terminale Sequenzanalyse Klonierung und DNA-Sequenzanalyse der flankierenden Bereiche des asplb-gens Klonierung und DNA-Sequenzanalyse des asplb-gens Vergleichende Sequenzanalysen der Proteine CspL und CspLB Funktionsanalysen des orplb-gens durch Konstruktion einer EGD::AaspLB- Deletionsmutante Konstruktion der EGD::A«pLB-Deletionsmutante Charakterisierung der EGD::AaspLB-Deletionsmutante Transkriptionsstudien Transkriptionsanalyse des csplb-gens Transkriptionsanalyse desy7a/4-gens Kartierung der Transkriptionsstartpunkte des cyplb-gens durch Primer Extension Promotorsequenz des cyplb-gens Ribosomenbindungsstelle DISKUSSION Bedeutung desy?a/?-gens für die Regulation des Flagellins Charakterisierung des aspl-gens Charakterisierung des csplb-gens ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY LITERATURVERZEICHNIS 172
6 10 ANHANG DNA-Sequenzen yfaä-genlokus cspl-genlokus csplb-genlokus Vergleichende Datenbankanalysen Ähnlichkeitsstudien zu den Proteinsequenzen der N-terminalen Proteinsequenzanalysen Offene Leserahmen der cspl- und ayplb-genloki 217
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