Nils Köhler (Autor) Entwicklung und Anwendung leistungsfähiger präparativer gegenstromverteilungschromatographischer Trenntechniken

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Ferdinand Kirchner
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gegenstromverteilungschromatographischer Trenntechniken

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1 Nils Köhler (Autor) Entwicklung und Anwendung leistungsfähiger präparativer gegenstromverteilungschromatographischer Trenntechniken Copyright: Cuvillier Verlag, Inhaberin Annette Jentzsch-Cuvillier, Nonnenstieg 8, Göttingen, Germany Telefon: +49 (0) , Website:

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung und Kenntnisstand Polyphenole Allgemeine Klassifizierung der Polyphenole Anthocyanidine Flavan-3-ole (Catechine) Proanthocyanidine (kondensierte Tannine) Allgemeines Procyanidine (B-Typ Procyanidine) A-Typ Procyanidine Reaktionen von Proanthocyanidinen im sauren Milieu Epimerisierungen Vorkommen von Proanthocyanidinen Vorkommen von Proanthocyanidinen in Nahrungsmitteln Vorkommen von Proanthocyanidinen in ausgewählten Naturstoffen Traubenkernextrakte (Vitis vinifera) Kakaobohnen (Theobroma cacao) Kastanien (Aesculus hippocastanum) Biosynthese von Polyphenolen Biosynthese der Flavanoide Biosynthese der Proanthocyanidine Physiologische Wirkungen von Proanthocyanidinen Gesundheitsfördernde Wirkungen von Proanthocyanidinen Bioverfügbarkeit von Proanthocyanidinen Countercurrent Chromatography (CCC) Einleitung Historische Entwicklung Prinzipien der Gegenstromverteilungschromatographie Hydrostatisches Prinzip Hydrodynamisches Prinzip High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) Planetares Prinzip Trennleistung der HSCCC Aufbau einer CCC-Anlage Auswahl der Fließmittelsysteme Berechnung der Retention an stationärer Phase (R s ) und des Verteilungskoeffizienten (K) Low Speed Rotary Countercurrent Chromatography (LSRCCC) Das Prinzip der LSRCCC Cross-Axis CCC Spiral-Disk für die HSCCC Weitere Anwendungsmethoden in der modernen CCC ph-zone Refining CCC Kopplung der CCC mit der Massenspektrometrie... 43

3 Chirale Trennungen Centrifugal Precipitation Chromatography Multidimensionale CCC Anwendung der Gegenstromverteilungschromatographie in der Naturstoff- und Lebensmittelchemie Zielsetzung Ergebnisse und Diskussion Analytik von Procyanidinen Allgemeines Reversed Phase HPLC Normalphasen-HPLC Dünnschichtchromatographie Strukturaussagen über die Messung des UV-Spektrums HPLC-MS-Kopplung Phloroglucinolyse Mechanismus und Prinzip der Phloroglucinolyse Isolierung von Standardsubstanzen mittels HSCCC Nebenprodukte der Phloroglucinolyse Aussagekraft der Phloroglucinolyse Phloroglucinolyse von kommerziellen Traubenkernextrakten Zusammenfassung der Analytik von Procyanidinen Isolierung von Procyanidinen Isolierungsstrategie Pentanfällung Isolierung von Procyanidinen mittels HSCCC Probenaufarbeitung durch Pentanfällung Polyamid Fraktionierung Isolierung von Procyanidinen (B-2, B-5 und C-1) aus Kakaosamen Isolierung von A-Typ Procyanidinen aus Kastanienschalen Fazit Präparative Darstellung von Procyanidinen Reaktionsmechanismus Optimierung der Synthesebedingungen Isolierung der Reaktionsprodukte der Semisynthese mittels HSCCC Semisynthese mit Catechin Semisynthese mit Epicatechin Semisynthese mit Catechin und anschließender Pentanfällung Semisynthese mit Epicatechin und anschließender Pentanfällung Zusammenfassung der Procyanidin Semisynthese Strukturaufklärung der isolierten Procyanidine LC-MS-Untersuchungen Procyanidine vom B-Typ Procyanidine vom A-Typ Flavan-3-ol-Phloroglucinol-Addukte Nebenprodukte der Phloroglucinolyse

4 Chalcan-Phloroglucinol [1,3-Di-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-1-(3,4-dihydroxyphenyl)-propan-2-ol] Dimere Procyanidin-Phloroglucinol-Addukte Die Chalcan-Flavan-3-ol-Dimere (Gambiriine) Die Chalcan-Flavan-3-ol-Phloroglucinol-Addukte NMR-Spektroskopie Phloroglucinolyse Circulardichroismus (CD) Strukturaufklärung isolierter Verbindungen Charakterisierung der Flavan-3-ol-Phloroglucinol-Addukte Charakterisierung der Nebenprodukte der Phloroglucinolyse Charakterisierung der Procyanidine Procyanidin B1 (13) Procyanidin B7 (21) Procyanidin B2 (15) Procyanidin B5 (20) Procyanidin B3 (16) Procyanidin B4 (17) Procyanidin C1 (14) EC-4 6-EC-4 8-EC (32) EC-4 6-EC-4 6-C (36) Cinnamtannin A 2 (18) (-)Epicatechin-3O-gallat-4 8-(-)epicatechin (ECG-4 8-EC) (33) (-)Epicatechin-4 8-(-)epicatechin-3O-gallat (EC-4 8-ECG) (28) (-)Epicatechin-4 8-(-)epicatechin-3O-gallat (EC-4 8-ECG) (28) und (-)Epicatechin-3O-gallat-4 6-(-)epicatechin (ECG-4 6-EC) (27) (-)Epicatechin-3O-gallat-4 6-(+)catechin (ECG-4 8-C) (19) (-)Epicatechin-2 O7, 4 8-(-)catechin (Procyanidin A4) (26) (-)Epicatechin-2 O7, 4 8-(-)epicatechin (Procyanidin A2) (25) Charakterisierung der Chalcan-Flavan-3-ol-Dimere (Gambiriine) Entwicklung neuer leistungsstarker präparativer CCC-Prototypen Low Speed Rotary Countercurrent Chromatography (LSRCCC) Der LSRCCC-Prototyp Durchführung von Retentionsstudien Fließmittelsystemvalidierung zur Isolierung von Procyanidinen Fraktionierung von Procyanidinen Testung weiterer Fließmittelsysteme Hydrodynamisches Fließverhalten in der LSRCCC Applikationen der LSRCCC Isolierung von Cyanidin-3-glucosid aus Brombeersaftkonzentrat Isolierung von Anthocyanen aus Schwarzem Johannisbeer-Konzentrat Fraktionierung von Anthocyanen aus Blutorange Fraktionierung von Anthocyanen der roten Süßkartoffel Schlussfolgerung zur Anwendung der LSRCCC Spiral-Coil Assembly für die LSRCCC Einführung Entwicklung eines ersten Prototypen

5 Der Spiral-Effekt Elutionsmodi Retentionsstudien Fließmittelsystem CHCl 3 / Wasser (1: 1, v/v) Fließmittelsystem n-butanol/ Essigsäure/ Wasser (4:1:5, v/v/v) Untersuchung der Trennbedingungen CHCl 3 -Wasser-System Butanol-Essigsäure-Wasser-System Schlussfolgerungen zur Entwicklung der Spiral-Coil LSRCCC Neuer Prototyp mit variablem Volumen Fließmittelsystem TBME/ n-butanol/ Wasser (4,3:0,7:5, v/v/v) Einfluss der Fließgeschwindigkeit Fazit Zusammenfassung Material und Methoden Proben und Chemikalien Probenmaterial Chemikalien Präparative Methoden Extraktionen Herstellung des Kakaoextraktes Herstellung des Kastanienschalenextraktes Pentanfällung Fraktionierte Pentanfällung des Traubenkernextraktes Fällung des Traubenkernextraktes (Präparativer Maßstab) Fällung des Kastanienextraktes Fällung des Kakaoextraktes Fällung des Reaktionsgemisches der Semisynthese (HSCCC) Fällung des Reaktionsgemisches der Semisynthese (LSRCCC) Polyamid-Festphasenextraktion Phloroglucinolyse zur Isolierung der Spaltprodukte Semisynthetische Darstellung von Procyanidinen Optimierung der Reaktionsbedingungen Reaktionsansatz zur Isolierung von Procyanidinen mittels CCC Amberlite XAD-7 Festphasenextraktion High-Speed Countercurrent Chromatography (HSCCC) Low Speed Rotary Countercurrent Chromatography (LSRCCC) Spiral-Coil LSRCCC Erster Prototyp Zweiter Prototyp HPLC Analytische Methoden Dünnschichtchromatographie Dünnschichtchromatographie für die Analytik von Procyanidinen Dünnschichtchromatographie für die Analytik von Anthocyanen

6 HPLC System I System II (Normal Phasen HPLC) HPLC-MS HPLC Methoden Phloroglucinolyse Phloroglucinolyse zur Analyse von procyanidinhaltigen Extrakten Phloroglucinolyse zur Strukturaufklärung isolierter Verbindungen NMR Circulardichroismus Bestimmung der Verteilungskoeffizienten von Procyanidinen Physikochemische Eigenschaften der Fließmittelsysteme Bestimmung der Dichte Bestimmung der Viskosität Bestimmung der Grenzflächenspannung Literatur Anhang Zusammenfassung aller charakterisierten Verbindungen Retentionsstudien FS-XI: Chloroform/ Wasser (1: 1, v/v) FS-XII: Hexan/ Methanol (2: 1, v/v) FS-XIII: Hexan/ Ethylacetat/ Methanol/ Wasser (1: 1: 1: 1, v/v/v/v) FS-XIV: Hexan/ Ethylacetat/ Methanol/ Wasser (2: 5: 2: 5, v/v/v/v) FS-XV: Hexan/ Ethylacetat/ Methanol/ Wasser (1: 5: 1: 5, v/v/v/v) FS-III: Hexan/ Ethylacetat/ Methanol/ Wasser (1: 10: 1: 10, v/v/v/v) FS-V: Ethylacetat/ 2-Propanol/ Wasser (20: 1: 20, v/v/v) FS-VI: Ethylacetat/ n-butanol/ Wasser (14: 1: 15, v/v/v) FS-X: TBME/ n-butanol/ Wasser (4,3: 0,7: 5, v/v/v) FS-XVI: TBME/ n-butanol/ MeCN/ Wasser (3: 1: 1: 5, v/v/v/v) FS-XVII: TBME/ n-butanol/ MeCN/ Wasser (2: 2: 1: 5, v/v/v/v) FS-XVIII: TBME/ n-butanol/ MeCN/ Wasser (1: 3: 1: 5, v/v/v/v) FS-XIX: n-butanol/ Essigsäure/ Wasser (4: 1: 5, v/v/v)

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