Der Zellzyklus und mögliche Störungen durch chemische Substanzen

Transkript

1 Teil 2 Der Zellzyklus und mögliche Störungen durch chemische Substanzen Aplasie Hemmung der Zellzyklusprogression Gesteigerte oder unkontrollierte Zellzyklusprogression Hyperplasie Karzinogenese

2 Proliferierende Hepatozyte

3 Proliferation bei der Leberregeneration Hoehme et al., PNAS, 107(23), , 2010

4 Proliferierende Tumorzellen

5 Proliferation von Tumorzellen

6 Multistep Process of Carcinogenesis Metabolic activation Procarcinogen Genotoxic carcinogen DNA damage Proliferation DNA mutations Proliferation Threshold mechanisms Metabolic inactivation DNA repair Cell cycle arrest Apoptosis Multistep process of oncogene activation and tumor suppressor inactivation Proliferation Tumor Apoptosis Control by immune system

7 Die Stadien des Zellzyklus Aus: Lodish, Molekulare Zellbiologie

8 Cycline und Cyclin abhängige Kinasen (cdc): Motoren des Zellzyklus cdc Cyclin abhängige Kinase (cdc) ohne Cyclin: inaktiv Cyclin cdc mit Cyclin: aktiv

9 Cycline und Cyclin abhängige Kinasen (cdk): Motoren des Zellzyklus cdk Cyclin abhängige Kinase (cdk) ohne Cyclin: inaktiv Cyclin cdk mit Cyclin: aktiv Phosphorylierung von Proteinen an Serin o. Threonin Aktivierung bzw. Inaktivierung nachgeschalteter Faktoren

10 Beispiel: Aktivierung der cdk2 durch Komplexbildung mit Cyclin A cdk2 cdk2 Cyclin A

11 Oszillation der Cycline Cyclin D E A B Konzentration in der Zelle G1 S G2 M Stadien des Zellzyklus

12 Gegenwärtiges Modell für Säugerzellen

13 Warum werden Cycline zu definierten Zellzyklusphasen wieder abgebaut? Ubiquitinligase (APC) Aus: Lodish, Molekulare Zellbiologie

14 Regulation des Abbaus von Cyclin B /cdk 2 - Die Bindung des Erkennungsproteins (APC) ist Voraussetzung dafür, daß die Ubiquitin-Ligase aktiv werden kann. - Es gibt für viele Proteinklassen unterschiedliche Erkennungsproteine, aber nur eine Ubiquitinligase. MPF: Mitose promovierender Faktor; APC: Anaphase promoting complex (Erkennungsprotein)

15 Gegenwärtiges Modell für Säugerzellen

16 Die D-Cycline: Sensoren für Wachstumsfaktoren Wachstumsfaktor Rezeptor Zelle Signaltransduktions-Kaskade Verstärkte Transkription von Cyclin D Kern Aktivierung von cdk4, cdk6 G1 spezifische cdk/cyclin-komplexe

17 G1-spezifische cdk/cyclin-komplexe aktivieren den Transkriptionsfaktor E2F E2F stimuliert die Transkription von Cyclin E / cdk2 Aktiver Cyclin E / Cdk2-Komplex Transkription von u.a: Dihydrofolatreduktase DNA-Polymerase α Cdc2 Cyclin A Übergang in die S-Phase

18 Gegenwärtiges Modell für Säugerzellen

19 Voraussetzung für die Zellteilung: Auflösung der Kernmembran Aufbau der Kernmenbran Elektronenmikroskopische Aufnahme der Kernfaserschicht Kernmembran: nuclear membrane Kernfaserschicht: nuclear lamina

20

21 Lamin-Dimere polymerisieren zu Filamenten Phosphorylierung der Dimere an endständigem Serin treibt die Lamin-Dimere auseinander

22 Aktives Cyclin B / cdk2: Auslösung der Mitose Frühe Mitosevorgänge sind Folgen der Phosphorylierung durch Cyclin B / cdc2 (MPF) Beispiel Nr. 1: - Phosphorylierung von Kernlaminen (Lamin A) Depolymerisation Auflösung der Kernmembran - Phosphorylierung von Histon H1 Kondensation der Chromosomen

23 Trennung der Schwesterchromatiden nach Proteolyse der Proteinbrücke

24 Abbau von Cyclin B: Abschluß der Mitose Späte Mitosevorgänge sind Folgen der Dephosphorylierung durch konstitutiv aktive Phosphatasen nach Abbau von Cyclin B / cdc2 Beispiel Nr. 1: Dephosphorylierung von Myosin Steigerung der Kontraktilität des Myofilaments Schwesterchromatide werden getrennt

25 Gegenwärtiges Modell für Säugerzellen

26 Steigerung der Kontraktilität von Myofilamenten: Ausfall der Phosphorylierung der inhibitorischen Stelle des Myosins nach Abbau von Cyclin B

27 Abbau von Cyclin B: Abschluß der Mitose Späte Mitosevorgänge sind Folgen der Dephosphorylierung durch konstitutiv aktive Phosphatasen nach Abbau von Cyclin B / cdc2 Beispiel Nr. 2: Dephosphorylierung von Laminen der Kernmembran Negative Ladung der Lamin-Dimere wird aufgehoben Polymerisierung und Neubildung der Kernmembran wird wieder möglich

28 Neubildung der Kernmembran werden dephosphoryliert

29 Gegenwärtiges Modell für Säugerzellen

30 Regulation der Cdks 1. P53 DNA-Schädigung P53-Akkumulation Transkription von P21 (synonym: CIP1 oder WAF1) Bindung an: - cdk4 / Cyclin D - cdk2 / Cyclin E Inaktivierung G1 - Block

31 2. Aktivierende und inaktivierende Domäne der cdk 2 Aktivierende Domäne: Phosphorylierung durch CAK (cdc aktivierende Kinase) (= cdc 7 / Cyclin H) durch Phosphorylierung dieser aktivierenden Domäne (Thr-161) wird das katalytische Zentrum mit der ATP- Bindestelle frei (siehe Bild: DeBond et al., Nature 363, 595, 1993) Inaktivierende Domäne: - Wee 1 phosphoryliert und inaktiviert somit cdk2 - cdc25 dephosphoryliert und aktiviert somit cdk 2

32 3. Die INK-Familie Wichtigste Vertreter: p15ink4b, p16ink4a, p18ink4c, p19ink4d Mechanismus: Bindung an cdk4 und/oder cdk6 Abdissoziation von Cyclin D G1-Block 4. p21, p27, p57 Mechanismus: (i) Bindung an cdk4-, cdk6-, cdk2-cyclin Komplexe Inaktivierung (ii) Hemmung von CAK (Hemmung der Phosphorylierung der aktivierenden Domäne von cdc 2)

33 Aktive Form der cdk2 (MPF) Cyclin B cdk2 In- Aktivierende aktivierende Domäne Domäne

34 Krebs durch Störungen der Zellzykluskontrolle - Mutationen im P53-Gen (erblich: Li-Fraumeni) - Mutationen im Rb-Gen (erblich: Retinoblastom) Auslösende Substanzen: alle gentoxischen Mutagene

35 Krebs durch Störungen der Zellzykluskontrolle - Überexpression von Cyclinen Beispiel: Integration des Hepatitis B-Virus vor das Cyclin A-Gen Chimäres Protein, mit nicht-funktioneller Abbau-Sequenz - Zervixkarzinom durch Infektion mit dem Papillomvirus (HPV) HPV Expression der Proteine: E6 Bindung an p53 E7 Bindung an Rb Folgen: Inaktivierung von p53 und Rb

36 Fusion mitotischer Zellen mit in der G1-Phase befindlichen Zellen

37 Nachweis, daß die Phosphorylierungsstelle des Lamin A (Serin) für die Auflösung der Kernfaserschicht unerlässlich ist: - Gerichtete Mutagenese: Ersatz des Serins der normalen Phosphorylierungsstelle durch Alanin. Alanin kann nicht phosphoryliert werden. - Nachweis von Lamin A mit Fluorochrom-markierten Antikörpern - Nachweis von DNA mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI Mutiertes Lamin A verhindert die Auflösung der Kernfaserschicht und die Trennung der Tochterkerne aus : Heald and McKeon, Cell 61, 579, 1990

38 Färbung von Lamin Wildtyp Färbung von DNA Mutierte Phosphorylierungsstelle Färbung von Lamin Färbung von DNA

39 Nachweis, daß p53 für den G1-Block verantwortlich ist Kuerbitz et al., PNAS 89, 7491, 1992

40 Nachweis der Induktion von Zellzyklusprogression durch Die G1-Cycline (Cln1, Cln2, Cln2) bei Hefen - Glucose inaktiviert den GAL1-Promotor - Überexpression von Cln3 nach Glucoseentzug Zunahme der Zellzahl in der S- und G2-Phase Richardson et al., Cell 59, 1989

41 Nachweis, daß Cyclin D für die DNA-Synthese unerläßlich ist DNA-Färbung mit DAPI Fluoreszein gekoppelter Antikörper gegen BRDU Texasrot gekoppelter Zweit-Antikörper gegen den Anti- Cyclin D Antikörper Baldin et al., Genes Dev. 7, 812, 1993

42 Die Stadien des Zellzyklus Aus: Lodish, Molekulare Zellbiologie