Reagenzien-Wegweiser für das LightCycler 480 System

Transkript

1 Reagenzien-Wegweiser für das LightCycler 480 System qpcr Reagenzien in Premium Qualität für jede Applikation die optimale Lösung

2 Roche Applied Science Haben Sie schon Ihr optimales LightCycler 480 Reagenz DNA Ist Ihr Aufreinigungsmaterial Nutzen Sie unsere optimierten DNA Aufreinigungs-Kits für Ihre Real Time PCR: zur manuellen Aufreinigung: High Pure PCR Template Preparation Kit für Zellen, Gewebe, Vollblut, Hefen und Bakterien High Pure Viral Nucleic Acid Kit für Serum, Plasma, Vollblut High Pure Plasmid Isolation Kit für Plasmid-DNA Best.-Nr.: (100 Aufr.) Best.-Nr.: (100 Aufr.) Best.-Nr.: (50 Aufr.)/ Best.-Nr.: (100 Aufr.) weitere Aufreinigungskits und Packungsgrößen siehe zur automatisierten Aufreinigung: MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I für Serum, Plasma, Vollblut, Kulturzellen MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit für Serum, Plasma, Vollblut Best.-Nr.: (32 Aufr.) Best.-Nr.: (192 Aufr.) weitere Aufreinigungskits und Packungsgrößen siehe Welches Detektionsformat bevorzugen Sie für Ihre PCR? Sequenzunabhängiges Format SYBR Green I LightCycler 480 SYBR Green I Master geeignet für qualitative und quantitative Untersuchungen, sowie zur Produktidentifikation über Schmelzkurvenanalyse Amplikonlänge: optimal 500 bp, geeignet bis 750 bp hohe Sensitivität und hohe Reproduzierbarkeit Best.-Nr.: (500 Reakt.) Best.-Nr.: (5000 Reakt.) Ready-to-use 2x-konz. HotStart Mastermix Stabil bei RT für 24 h ohne Effizienzverlust, bei 4 C für 4 Wochen Gesamtassay-Dauer ca. 45 Min. (40 Zyklen) + optional 5 Min. Schmelzkurve mit oder ohne Schmelzkurvenanalyse Sequenzspezifisches Format High Resolution Melting (HRM) LightCycler 480 High Resolution Melting Master in Kombination mit der LightCycler 480 Gene Scanning Software (Best.-Nr.: ) ideal geeignet zur Detektion von bekannten und unbekannten SNPs (single nucleotide polymorphisms) Amplikonlänge: optimal 300 bp, geeignet bis 500 bp Best.-Nr.: (500 Reakt.) optimiert für hochspezifische Target-Amplifikation 2x-konz. HotStart Mastermix dntp Mix mit dutp anstatt dttp (ermöglicht Carry-over Prevention) Gesamtassay-Dauer ca. 75 Min. (45 Zyklen) ohne Schmelzkurvenanalyse Sonden wie HybProbe, SimpleProbe LightCycler 480 Genotyping Master geeignet für Genotyping- und Multiplex-Real Time PCR Amplikonlänge: optimal bp für Monoplex Assays, 350 bp für Multiplex Assays, geeignet bis 750 bp hohe Sensitivität und hohe Reproduzierbarkeit Ready-to-use 5x-konz. HotStart Mastermix Best.-Nr.: (384 Reakt.) stabil bei RT für 24 h ohne Effizienzverlust, bei 4 C für mehrere Wochen keine 5'-3'-Exonuklease Aktivität dntp Mix mit dutp anstatt dttp (ermöglicht Carry-over Prevention) Gesamtassay-Dauer ca. 50 Min. (40 Zyklen) Sonden wie Hydrolysis Probes (TaqMan, Universal ProbeLibrary) Sonden wie HybProbe, SimpleProbe LightCycler 480 Probes Master sequenzspezifische DNA-Detektion, geeignet für qualitative und quantitative Analysen Amplikonlänge: optimal 500 bp, möglich bis 1000 bp höchste Sensitivität und hohe Reproduzierbarkeit Ready-to-use 2x-konz. HotStart Mastermix Best.-Nr.: (500 Reakt.) Best.-Nr.: (5000 Reakt.) Best.-Nr.: (5000 Reakt.) Stabil bei Raumtemperatur für 24 h ohne Effizienzverlust, bei 4 C für 4 Wochen 5'-3'-Exonuklease-Aktivität dntp Mix mit dutp anstatt dttp (ermöglicht Carry-over Prevention) Gesamtassay-Dauer ca. 40 Min. (40 Zyklen)

3 gefunden? DNA oder RNA? RNA Nutzen Sie unsere optimierten RNA Aufreinigungs-Kits für Ihre Real Time PCR: zur manuellen Aufreinigung: High Pure RNA Isolation Kit für kultivierte Zellen, Vollblut, Hefen und Bakterien High Pure RNA Tissue Kit für Gewebe High Pure Viral RNA Kit für Serum, Plasma, andere Körperflüssigkeiten Best.-Nr.: (50 Aufr.) Best.-Nr.: (50 Aufr.) Best.-Nr.: (100 Aufr.) weitere Aufreinigungskits und Packungsgrößen siehe zur automatisierten Aufreinigung: MagNA Pure Compact RNA Isolation Kit I für Gewebe, Kulturzellen, Vollblut MagNA Pure LC mrna Isolation Kit I für Vollblut, Blut-, Kulturzellen Best.-Nr.: (32 Aufr.) Best.-Nr.: (192 Aufr.) weitere Aufreinigungskits und Packungsgrößen siehe Möchten Sie eine One-Step oder eine Two-Step RT-PCR durchführen? * cdna Synthese: Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit Ready-to-use Kit für alle RNA-Targets mit effizienter Transkription selbst bei hohem GC-Gehalt Realistische Wiedergabe der Gen-Expression durch lineare Transkription sowohl seltener als auch häufiger RNA-Moleküle in einer Reaktion Funktionsgetestet mit LightCycler FastStart DNA Kits Flexibel durch verschiedene Priming-Methoden (Oligo(dT) 10, Random Hexamere, Sequenz-spezifische Primer) Best.-Nr.: (50 Reakt., beinhaltet 10 Kontroll-Reakt.) Best.-Nr.: (100 Reakt.) Best.-Nr.: (200 Reakt.) Two-Step- RT-PCR One-Step- RT-PCR Transcriptor Reverse Transcriptase Einzelenzym inclusive Puffer zur effektiven Transkription von RNA Best.-Nr.: (25 Reakt.) Best.-Nr.: (50 Reakt.) Best.-Nr.: (200 Reakt.) Sondenformat Hydrolysis Probes (TaqMan, Universal ProbeLibrary) LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probes mit Aktivator (Mn(OAc) 2 ) zur Sicherstellung einer spezifischen und effizienten Amplifikation mit Enhancer zur Amplifikation schwieriger (GC reicher) Sequenzen Amplikonlänge möglich bis 500 bp, optimal 100 bp Analyse von 3-4 Target RNAs im selben Ansatz möglich 2,7 x konz. HotStart Mastermix enthält robuste Tth DNA-Polymerase dntp Mix mit dutp anstatt dttp (ermöglicht Carry-over Prevention) sehr schneller Assay: Gesamtdauer ca. 40 Min. (für 45 Zyklen) Best.-Nr.: (500 Reakt.) Universal ProbeLibrary (Hydrolysis Probes) das einfache, flexible und schnelle System für die Genexpressionsanalyse über 2 Millionen ready-to-order prävalidierte Assays quantifizieren nahezu jedes Transkript einfaches Sondendesign vielseitige Applikationsmöglichkeiten die preiswerte Alternative zu Customized Assays Universal ProbeLibrary Set, Human Universal ProbeLibrary Set, Rat Universal ProbeLibrary Set, Mouse Universal ProbeLibrary Sonden, (je 1 Sonde) Best.-Nr.: (1 Set aus 90 Sonden) Best.-Nr.: (1 Set aus 90 Sonden) Best.-Nr.: (1 Set aus 90 Sonden) Best.-Nr.: siehe Product List * Entscheidungskriterien werden im Glossar angeführt

4 Glossar Detektionsformate Vorteile Nachteile Sequenzunabhängiges Format SYBR Green I High Resolution Melting (HRM) Farbstoff Sequenzspezifisches Format HybProbe Probes (Hybridisierungssonden) Hydrolysis Probes (Hydrolysesonden, TaqMan Sonden) SimpleProbe Probes Einfache Handhabung Kein Sonden-Design erforderlich Qualitative Detektion Quantifizierung Produktidentifikation über Schmelzkurvenanalyse möglich Prüfung der PCR Qualität über Detektion von Primer Dimeren und anderen unspezifischen PCR Produkten möglich im Vergleich zu SYBR Green I: Detektion unbekannter Mutationen Bindet gleichmäßig und sättigend an dsdna Keine Umlagerung des Farbstoffs Stabiler Bessere Signaldynamik Leichter zu analysierender Schmelzkurvenverlauf Beeinträchtigt nicht die PCR Performance Qualitative Detektion Quantifizierung Produktidentifikation über Schmelzkurvenanalyse möglich Mutationsanalyse mit höchster Spezifität, z.b. Detektion von Punktmutationen Multiplexing möglich Für längere Amplifikate bis 1000 bp geeignet Nur 1 Sonde erforderlich Viele etablierte Sondensequenzen Punktmutationen darstellbar Allel-spezifische Quantifizierung möglich Nur 1 Sonde erforderlich Einfache Handhabung Ideal für SNP-Genotypisierung Nicht zur Mutationsdetektion geeignet, da nicht sequenz-spezifisch Punktmutationen nur eingeschränkt darstellbar Kein Multiplexing möglich Kein Multiplexing möglich Zwei Sonden erforderlich Keine Schmelzkurvenanalyse möglich Nur für kurze Amplifikate geeignet, optimal 500 bp Aufwendiges ProbeDesign Ausschließlich für SNP-Analyse geeignet Niedrige Fluoreszenzsignalintensität Erhöhung der Spezifität einer PCR HotStart PCR Durchführung der HotStart Methode mit der FastStart Taq DNA Polymerase Reduzierung der Bildung unspezifischer Produkte, da die Taq DNA Polymerase erst bei hohen Temperaturen aktiviert wird. Taq DNA Polymerase wird durch Bindung von hitzelabilen Gruppen (Adaptamere) chemisch modifiziert und damit inaktiviert. Bei höheren Temperaturen ( > 75 C) wird die Inaktivierung aufgehoben und das Enzym ist nach 5 10 Minuten Denaturierung bei 95 C aktiv.

5 RT-PCR RT-PCR besteht aus zwei Schritten: 1. Ausgangsmaterial ist mrna, die im ersten Schritt in der Reversen Transkription (RT) in cdna umgeschrieben wird. 2. Im zweiten Schritt wird diese cdna mittels PCR amplifiziert. One-Step RT-PCR Transkription der mrna in cdna und die anschließende PCR wird direkt hintereinander im gleichen Reaktionsgefäß durchgeführt. Alle Reaktionskomponenten werden bereits vor Beginn des Experimentes zugegeben ( im Gegensatz zur Two-Step RT-PCR). Vorteile Einschränkung Kontaminationsrisiko wird deutlich minimiert, da das Reaktionsgefäß nicht mehr geöffnet wird. Zeitersparnis, da weniger Pipettierschritte notwendig sind und diese leicht automatisiert werden können. Eventuell müssen optimale Reaktionsbedingungen variiert werden, um der nachfolgenden PCR-Reaktion Rechnung zu tragen und umgekehrt. Durch Wahl optimierter Puffersysteme für eine One-Step RT-PCR kann dies umgangen und so zeitaufwendige Optimierungsarbeit erspart werden. Es kann je RT-PCR nur ein spezifisches Fragment aus der Gesamt mrna amplifiziert werden. Je nach Fragestellung kann die Durchführung einer Two-Step RT-PCR sinnvoller sein. Typische Anwendungsgebiete Two-Step RT-PCR Nachweis genetisch bedingter Krankheiten z.b. durch unterschiedliche Expression Optimal für absolute Quantifizierungen z.b. RNA-Viren Umschreibung der mrna in cdna und anschließende PCR wird in zwei Schritten durchgeführt: mrna wird zunächst in cdna transkribiert (z.b. mit dem Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit), in einer zweiten Reaktion wird die cdna amplifiziert (z.b. mit dem LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis Probes). Zwei Möglichkeiten der Durchführung: a.) Die Reaktionsschritte werden in zwei verschiedenen Gefäßen durchgeführt: In einem separaten Reaktionsgefäß wird die mrna unter Verwendung von Random Hexameren oder Oligo(dT) Primern in cdna umgeschrieben. Ein Aliquot dieser RT-Reaktion wird danach in ein neues Gefäß transferiert, in dem nun die PCR stattfindet. b.) Beide Reaktionsschritte werden im gleichen Reaktionsgefäß durchgeführt: Zuerst wird die RT- Reaktion durchgeführt. Anschließend werden in dem gleichen Ansatz die Komponenten (Puffer, DNA Polymerase, spezifische Primer etc.) für die nachfolgende PCR ergänzt. Vorteile Sowohl für die RT-Reaktion als auch für die PCR können die optimalen Reaktionsbedingungen gewählt werden. Hohe Flexibilität, denn Aliquots einer cdna können für verschiedene PCR-Reaktionen eingesetzt werden. Diese Flexibilität ist bei speziellen Applikationen (wie z.b. RACE oder Genexpressionsanalysen) erforderlich. Amplifikation sehr langer RNA-Bereiche (bis 12kb) durch variable Kombinationen von Reversen Transkriptasen mit DNA-Polymerasen. Einschränkung Höherer Zeitaufwand Erhöhtes Kontaminationsrisiko, da die Proben für die PCR-Reaktion in neue Reaktionsgefäße transferiert werden müssen. RT-PCR Puffer, die auf hohe Ausbeute hin optimiert wurden, können ggf. in einer nachfolgenden PCR-Reaktion inhibierend wirken. Bei dem Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit wurde dies berücksichtigt. Hier ist keine Aufreinigung der cdna vor dem Einsatz in die PCR notwendig. Typische Anwendungsgebiete Herstellung von Genbanken Quantitative Bestimmung von Genexpressionsraten

6 Primer Für die Reverse Transkription kann zwischen drei verschiedenen Typen von Primern gewählt werden: Oligo (dt)12-18 Primer Anchored Oligo (dt) 18 Primer sind modifizierte Oligo (dt) Primer, die an den poly(a)+ Schwanz am 3'-Ende der mrna von Eukaryonten binden und daher die Synthese einer full-length cdna noch verbessern (im Transcriptor First Strand cdna Kit enthalten). Random Hexanukleotid Primer binden an viele verschiedene Sequenzen in einer mrna. Bei Verwendung dieser Primer werden viele kurze cdna-stücke synthetisiert. sind ideal, wenn die RNA viele Sekundärstrukturen ausbildet. Besonders gut transkribiert werden auch 5'-Regionen der mrna. Sequenzspezifische Primer binden selektiv an die gesuchten mrna-bereiche und werden hauptsächlich bei der One-Step RT-PCR eingesetzt, da sie nach der RT-Reaktion auch in der PCR-Reaktion als Primer dienen. höhere Ausbeute Optik des LightCycler 480 Instrument Xenonlampe 430 nm 630 nm Anregungsfilter 450 nm 483 nm 483 nm 523 nm 558 nm 615 nm Detektionsfilter 500 nm 533 nm 533 nm 568 nm 610 nm 640 nm 670 nm Farbstoffe (z.b.) LightCycler Cyan 500 SYBR Green I Fluorescein (Fluos/FAM) HEX (VIC) LightCycler Red 610 LightCycler Red 640 Cy5 Detektionsformat Hydrolysis Probes (R) SYBR Green I, HRM Farbstoff Hydrolysis Probes (R), HybProbe Probes (D) Hydrolysis Probes (R), HybProbe Probes (A) SimpleProbe Probes (R) Reporter (R), Donor (D), Akzeptor (A) Die Xenon Lampe emittiert Licht über einen breiten Wellenlängenbereich von nm. Die 5 Anregungs- und 6 Detektionswellenlängen ermöglichen die Verwendung einer breiten Palette an Assay-Formaten und aller gängigen Real Time PCR-Fluorochrome. So können z.b. HybProbe, Hydrolysis und SimpleProbe Probes, sowie SYBR Green I und High Resolution Melting (HRM) Farbstoff eingesetzt werden. Bei fachlichen Anfragen erreichen Sie uns unter: Telefon: mannheim.biocheminfo@roche.com Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 116 D Mannheim For general laboratory use. Not for use in diagnostic procedures. The LightCycler is an Authorized Thermal Cycler. Purchase and use of the LightCycler, in conjunction with Authorized Reagents, provides a limited license for use of the PCR process in life science research. No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implication or by estoppel under patents owned by Roche Molecular Systems, Inc., F. Hoffmann-La Roche Ltd, or Applera Corporation claiming homogeneous or real-time amplification and detection methods. LIGHTCYCLER, FASTSTART, TAQMAN, HYBPROBE and SIMPLE PROBE are trademarks of Roche. PROBE LIBRARY is a registered trademark of Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark. SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. The technology used for the LightCycler System is licensed from Idaho Technology, Inc., Salt Lake City, USA ➀ 0607