Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

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1 UNTERSUCHUNGEN ZUM NICHTVIRALEN GENTRANSFER IN DIE LUNGE IM MAUSMODEL EINFLUSS DER APPLIKATIONSART, MOLEKULARBIOLOGISCHER FAKTOREN UND MAGNETISCHER DRUG TARGETINGMECHANISMEN Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von PETRA DAMES aus Heidenheim an der Brenz Berlin im Dezember 2007

2 1. Gutachter: Prof. Dr. Rainer H. Müller 2. Gutachter: Priv. Doz. Dr. Joseph Rosenecker Disputation am

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4 INHALTSVERZEICHNIS Inhaltverzeichnis Inhaltverzeichnis 1 Einleitung Methoden für den Gentransfer Aerosolgentherapie Gentransfer in die Lunge: Extra- und intrazelluläre Barrieren Polyethylenimin (PEI) als Vektor für die Aerosolgentherapie Magnetfeldgesteuerte Aerosolapplikation Steigerung der Gentransfereffizienz nichtviraler Genvektoren mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren Ziele der Arbeit Methoden Klonierung der Plasmid DNA Zellkulturen Detektion des CFP-GR Fusionsprotein mittels Epifluoreszenzmikroskopie Western Blot Analyse verschiedener Zelllysate Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Herstellung von DOTAP-Dexamethason Liposomen In vitro Transfektionen In vivo Applikation von pegfplucgre 0-2 Vektoren

5 INHALTSVERZEICHNIS Vernebelung und intranasale Instillation von PEI Genvektorkomplexen zur Untersuchung der Clearance bzw. der Lungenfunktion Bestimmung der pdna in Mauslungenkompartimenten mittels Real Time PCR Luziferaseaktivitätsmessung im Lungengewebe mit dem Röhrchenluminometer Versuche mit superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPION) Größenmessung mittels Photonenkorrelationsspektroskopie und Bestimmung des Zetapotentials Statistische Auswertung pdna-clearance und Kinetik der Luziferaseexpression in der Mauslunge nach Aerosolapplikation oder intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen Konzentrationsabhängige Stabilität von PEI-pDNA Komplexen Pulmonale pdna-clearance nach Aerosolapplikation oder intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen Untersuchung der Anzahl der BALF-Zellen und der aktivierten Makrophagen nach Aerosolapplikation oder nach intranasaler Instillation Kinetik der Luziferaseexpression nach Vernebelung oder nach intranasaler Instillation der PEI-pDNA Komplexe Zusammenfassende Betrachtung der Lungenclearance und der Kinetik der Luziferaseexpression Lungenfunktionsmessung nach Aerosolapplikation oder intranasaler Instillation von PEI-pDNA Partikeln Histologische Untersuchung des Lungengewebes der Mäuse nach Aerosolapplikation oder intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen...75

6 INHALTSVERZEICHNIS Lungenfunktionsmessung nach Aerosolapplikation bzw. intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen Lungenfunktionsmessungen nach Aerosolapplikation von PEI-pCpG oder PEI-CpGbackbone Zusammenfassung des Einflusses der Aerosolapplikation oder intranasalen Instillation auf die Lungenfunktion Untersuchung und Optimierung der magnetfeldgesteuerten Aerosolapplikation im Mausmodel SPION und pdna Deposition in der Mauslunge nach Vernebelung via intratrachealer Intubation Magnetfeldgesteuerte Aerosolgenapplikation in der Vernebelungskammer Zusammenfassende Betrachtung der Genexpression und pdna Deposition in Mauslungen nach magnetfeldgesteuerter Aerosolapplikation in der Vernebelungskammer Gentransfer mit Hilfe des Glucocorticoidrezeptors als Transkriptionsfaktor Nichtviraler Gentransfer mit Hilfe des Glucocorticoidrezeptors als Transkriptionsfaktor Bindungsaffinität des Glucocorticoidrezeptors an Hormone Responsive Elements Auswahl der zu klonierenden DNA Sequenz Konstruktion des pegfpluc mit enthaltenen GRE-Multimeren Der Glucocorticoidrezeptor als Transkriptionsfaktor im Zytoplasma Shuttling des Transkriptionsfaktors vom Zytoplasma in den Zellkern Bindung des Glucocorticoidrezeptors an die pdna Sequenz..122

7 INHALTSVERZEICHNIS Transfektion von BEAS-2B Zellen mit pegfplucgre Intravenöse Applikation von pegfplucgre 0-2 DOTAP-Dexamethason Liposomen Aerosolapplikation von PEI- pegfplucgre 0-2 in die Mauslunge Zusammenfassende Betrachtung des Gentransfers mit Hilfe des Glucocorticoidrezeptors als Transkriptionsfaktor Zusammenfassung Abstract Literaturverzeichnis Danksagung Publikationsliste Lebenslauf

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