Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

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1 Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik Dr. Maik Böhmer Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen Schlossplatz 7 Schwerpunkte: Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der Gentechnik Vorlesung 2: Methoden der Gentechnik Vorlesung 3: Vektoren & Klonierung Vorlesung 4: Reportergene Vorlesung 5: Transgene Organismen Vorlesung 6: Genomik und moderne Methoden Vorlesung 7: Proteine Enzyme der Gentechnologie I. Nukleasen 1. Restrikonsendonukleasen 2. Exonukleasen II. Modifizierende Enzyme 1. Ligasen 2. Phosphatasen / Kinasen / Transferasen III. Polymerasen 1. DNA - Polymerasen 2. RNA - Polymerasen 3. reverse Transkriptasen 1

2 Klonierung: Das Grundlegende Experiment der Gentechnologie DNA - Isolation: Wie erhalte ich die DNA die ich untersuchen möchte? 2

3 Aufbrechen der Zellen/Gewebe Zentrifugation: Trennung von Fraktionen/ Fällung rpm: rounds per minute RCF: relative Zentrifugalkraft g RCF=11,17 x r x (rpm/1000) 2 3

4 Phenolextraktion zum Abtrennen von Proteinen 1. Phenol 2. Phenol/Chloroform 3. Chloroform Ethanolfällung von Nukleinsäuren + 0,1 Vol. 3 M NaCl Vol. Ethanol 4

5 Reinigung von DNA an Silikat- und Anionenaustausch- Säulen Agarosegelelektrophorese Ethidiumbromid: 0,5 g/ml 5

6 Ethidiumbromid färbt DNA Agarose-Konzentrationen zur Separation von DNA-Fragmenten Fragmentlänge Agarosekonzentration 1-30 kb 0,5 % 0,8-12 kb 0,7 % 0,5-7 kb 1,0 % 0,4-6 kb 1,2 % 0,2-3 kb 1,5 % 0,1-2 kb 2,0 % 6

7 Gelelektrophorese zur Separation von DNA-Fragmenten Spannung: 0,5-5 V/cm Elektrodenabstand Gelelektrophorese zur Separation von DNA-Fragmenten 7

8 Gelelektrophorese zur Separation von DNA-Fragmenten: Das Prinzip Gelelektrophorese zur Separation von DNA-Fragmenten: Größenbestimmung 8

9 Autoradiographie zum radioaktiven Nachweis von Nukleinsäuren Southern Blot zum radioaktiven Nachweis von DNA 9

10 Southern Blot: Transfer der DNA-Fragmente Southern Blot: Transfer der DNA 10

11 Southern Blot Northern Blot zum radioaktiven Nachweis von RNA 11

12 Radioaktive Markierung von DNA - nick translation und end labeling Radioaktive Markierung von DNA - random priming 12

13 Nachweis von Nukleinsäuren-Hybridisierung Hybridisierung: 1. Denaturierung und Fixierung 13

14 Hybridisierung: 2. Hybridisierung mit markierter Sonde Hybridisierung: 3. Waschen und Exposition 14

15 Hybridisierung Nachweis von Nukleinsäuren: Kolonie-Hybridisierung 15

16 Oligonukleotide in vitro definiert synthetisierte einzelsträngige DNA Fragmente von meist ca. 20 Nukleotiden (im Normalfall kein 5 -Phosphat) z.b. 5 -CCGATGCACTGAATTC-3 Anwendung: Primer für random priming (Hexamere) Primer für primer extension Primer für PCR aber auch (doppelsträngige) Linker Adaptoren Linker 16

17 Adapter Oligonukleotid-Synthese I Nukleotid 1 an Glasmatrix gebunden: 5 OH-Gruppe liegt frei vor Folgenukleotid ist am 5 Ende mit einer DMT Schutzgruppe abgeschirmt DMT:4,4 -dimethoxytrityl am 3 Ende mit hochreaktiver Gruppe besetzt (z. B. Phosphoamidit) Nur das 3 Ende des Folgenukleotids kann mit Nukleotid 1 reagieren 17

18 Oligonukleotid-Synthese II Nach der Kopplung: Entfernung der Schutzgruppe vom 5 durch ZnBr 2 Stabilisierung der Phosphatgruppe durch Oxidation mit I 2 Oligonukleotid-Synthese III Nach der Synthese: Finale Entfernung der Methylgruppen (alkalisch) Lösen des Oligos von der Matrix 18

19 DNA-Sequenzierung Didesoxy-Methode nach Sanger DNA-Sequenzierung 19

20 DNA-Sequenzierung Radioaktive DNA-Sequenzierung 20

21 DNA-Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Animation Sequenzierung 21

22 Wichtige Begriffe der PCR Template: Substrat der PCR-Reaktion Primer: kurze Oligo-Nukleotide zur Initiation der Polymerisation dntps: Nukleotidtriphosphate werden in den neuen Strang eingebaut Polymerase: Enzym zur Synthese der Doppelstränge Denaturierung: Trennung der Doppelstränge bei C Annealing: Anlagerung der Primer an den geöffneten Doppelstrang Elongation: Neusynthese des fehlenden Doppelstrangs (1min/kb) Ablauf einer typischen PCR Amplifikation eines 1kb DNA Fragments: Initiale Denaturierung 2 min 95 C Denaturierung Annealing Elongation 30 sec95 C 45 sec55 C 60 sec72 C 40 Wiederholungen Finale Elongation 5 min 72 C 22

23 Anwendungen der PCR Amplifikation definierter DNA Fragmente Nachweis bestimmter Sequenzen im Genom geneitscher Fingerabdruck, Vaterschaftstest Nachweis von Mutationen Gendiagnostik Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung Nachweis von transgenen Organismen DNA Sequenzierung RT-PCR zum Nachweis von Genprodukten / Transkripten III Polymerasen - Thermostabile DNA Polymerasen - DNA abhängige Polymerasen, tolerant gegenüber hohen Temperaturen (~ 95 C) - besonders geeignet für PCR Reaktionen, Sequenzierungen Eigenschaften: Name Organismus 5 -Exonuclease 3 -Exonuclease Produkt- Enden ( Proofreading ) Taq Pol. Thermus aquaticus ja nein 3 A Pfu Pol. Pyrococcus furiusus ja ja glatt Pwo Pol. Pyrococcus woesei ja ja glatt Bedingungen: -Mg 2+, dntps, Primer (3 -OH Ende) 23

24 PCR PCR-Polymerase Ketten Reaktion 24

25 PCR PCR - im Überblick 30 Zyklen = 2 29 = Kopien 25

26 Animation PCR PCR- zur Klonierung von Fragmenten 26

27 PCR- zur Klonierung von Fragmenten RT- PCR 27

28 T - Klonierung und Xcm - Vektoren Xcm I: 5 -CCANNNNN/NNNNTGCC-3 GGTNNNN/NNNNNACGG Klonierungsvektoren - das Prinzip 28