Goertz O, Langer S, Homann HH, Steinstraesser L und Steinau. Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte -

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1 Intravitalmikroskopische Analyse von Perfusion, Leukozyten-Endothelzell-Interaktion und Neovaskularisation nach Verbrennung: Eine In-Vivo-Studie an SKH-1/hr Haarlosen Mäusen Goertz O, Langer S, Homann HH, Steinstraesser L und Steinau HU Klinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte - Handchirurgiezentrum BG-Universitätsklinik Bergmannsheil, Bochum ID-Nr.: 2309 Ole Goertz, In der Lake 17, D Witten, Tel.: , Fax: Summary: Breakdown of skin microcirculation is supposed to play a key role in pathophysiology of burn injury. Aim of the study was to develop a burn model, which allows the repetitive quantitative in vivo analysis of the microcirculation after burn injury with special focus on leukocyte endothelium interaction over a longer period of time. Male hairless mice were used. Deep partial thickness burns were inflicted in no-touch-technique to the ears. Intravital fluorescent microscopy in combination with FITC-dextran as plasmamarker was used to assess standard microcirculatory parameters. Leukocytes

2 were stained with rhodamine-6-g to study their interaction with the endothelium. Key words: Hairless mouse, burn model, intravital fluorescent microscopy, FITC-dextran, rhodamine-6-g, microcirculation, leukocyte endothelium interaction Zusammenfassung: Der Zusammenbruch der Mikrozirkulation der Haut spielt eine wesentliche Rolle in der Pathophysiologie nach Verbrennung. Ziel dieser Studie war es daher, ein Verbrennungsmodell zu entwickeln, das eine wiederholte und über einen längeren Zeitraum durchführbare quantitative in-vivo-analyse der Mikrozirkulation nach Verbrennungen erlaubt. Einen wesentlichen Schwerpunkt dabei bildete die Analyse der Leukozyten- Endothelzell-Interaktion. In den Ohren von männlichen Haarlosen Mäusen wurden ohne Gewebekontakt tief-zweitgradige Verbrennungen gesetzt. FITC-Dextran diente bei der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie als Plasmamarker zur Bestimmung mikrozirkulatorischer Standardparameter und Rhodamin-6-G der Leukozytenfärbung, die die Analyse der Interaktion der Leukozyten mit dem Gefäßendothel erlaubt. Schlüsselwörter: Haarlose Maus, Verbrennungsmodell, Intravitalmikroskopie, FITC-Dextran, Rhodamin-6-G, Mikrozirkulation, Leukozyten-Endothelzell-Interaktion

3 Hintergrund: Zur Pathophysiologie nach Verbrennung der Haut zählt neben dem direkten Zusammenbruch der Mikrozirkulation entscheidend der Ischämie/Reperfusions-Schaden, für den insbesondere die Leukozyten-Endothelzell-Interaktion verantwortlich gemacht wird. Ziel dieser Studie war es daher, ein Modell zu etablieren, das eine quantitative Analyse der Mikrozirkulation sowie der Interaktion zwischen Leukozyten und Gefäßendothel nach Verbrennungstrauma erlaubt. Material und Methoden: Als Modell diente die männliche Haarlose Maus (SKH-1/hr; n=9). Unter Isofluran-Narkose wurde das Ohr mit drei mikrochirurgischen Haltefäden fixiert und mit einer speziellen Vorrichtung ohne Gewebekontakt ein Verbrennungstrauma gesetzt (56 C/100s). Zur In-Vivo-Fluoreszenzmikroskopie wurde FITC- Dextran (150kDa) als Plasmamarker und Rhodamin-6-G zur Leukozytenfärbung als Bolus in eine Schwanzvene injiziert. Die mikrozirkulatorischen Parameter wurden mit Hilfe eines Intravitalmikroskops und einer Kamera über einen Videorekorder aufgezeichnet und zu einem späteren Zeitpunkt computer-assistiert (CapImage, Dr. Zeintl, Heidelberg) ausgewertet. Die intravitalmikroskopischen Aufnahmen in den identischen mikrozirkulatorischen Arealen erfolgten unmittelbar vor und nach Verbrennung, sowie an den Tagen 1, 3, 7 und 14. Folgende mikrozirkulatorische Parameter wurden erfasst: Größe des ischämische Areals, Durchmesser von Arteriolen und Venolen,

4 Erythrozytenfließgeschwindigkeit, die funktionelle Gefäßdichte als Parameter für die Gewebeperfusion, die Extravasation von FITC- Dextran als Maß für die Ödembildung und die Leukozyten- Endothelzell-Interaktion in Form von am Gefäßendothel entlang rollenden und adhärierenden Leukozyten. Ergebnisse: Es fand eine signifikante Reduktion des ischämischen Areals [mm 2 ] über den Beobachtungszeitraum statt. Am Tag 14 nach Verbrennung war die Perfusion des initial ischämischen Areals auf Grund der einsetzenden Neovaskularisationsprozesse wieder hergestellt (MW/SEM: 1,29±0,14, d 1; 0,02±0,01, d 14). Die funktionelle Gefäßdichte [cm/cm 2 ] um das verbrannt Areal verringerte sich unmittelbar nach Verbrennung, stieg dann im weiteren Verlauf auf einen Wert oberhalb des Kontrollwertes an, um am Tag 14 nach Verbrennung wieder Ausgangswerte anzunehmen. Beim Blutvolumenfluss der Venolen, errechnet aus dem Gefäßdurchmesser und der Erythrozytenfließgeschwindigkeit, kam es unmittelbar nach Verbrennung zu einem Anstieg um etwa 30%, der nach 24 Stunden wieder um etwa 50% abfiel. Am Tag 3 wurden wieder Ausgangswerte erreicht. Der Kurvenverlauf des Blutvolumenflusses der Arteriolen entsprach in etwa dem der Venolen. Die Extravasation von FITC-Dextran, dessen Fluoreszenzintensität sich proportional zur Konzentration verhält, wurde als Parameter für die Ödembildung verwendet. Es kam unmittelbar nach Verbrennung zu einem massiven Anstieg, der 24

5 Stunden später wieder stark zurückging und während des gesamten Beobachtungszeitraums auf einem Niveau oberhalb des Ausgangswertes blieb (MW/SEM: 0,52±0,02, Basiswert; 0,87±0,05, kurz nach Verbrennung; 0,65±0,02,d 1). Die Anzahl der adhärierenden Leukozyten [n/100µm und 60s] stieg unmittelbar nach Trauma signifikant an und erreichte nach 24 Stunden bereits wieder Ausgangswerte (MW/SEM: 0,77±0,23, Basiswerte; 4,45±1,73, unmittelbar nach Verbrennung; 1,41±0,55, d 1). Zusammenfassung: Das vorgestellte Modell am Ohr der Haarlosen Maus erlaubt die Visualisierung und quantitative Analyse der Mikrozirkulation und Leukozyten-Endothelzell-Interaktion nach Verbrennung. Die Parameter lassen sich wiederholt, in den unterschiedlichen Verbrennungszonen sowie im umliegenden gesunden Gewebe bestimmen. Weiterführende Studien zeigen, dass das Modell dafür geeignet ist, die Wirkungen von Stoffen auf die Mikrozirkulation, Leukozyten-Endothelzell-Interaktion und Neovaskularisation zu untersuchen. 1. Boykin JV, Eriksson E (1980) Plast Reconstr Surg, 66: Eriksson E, Boykin JV (1980) Microvasc Res 19: Barker JH, Hammersen F (1989) Plast Reconstr Surg 83: Bondar I, Uhl E (1991) Res Exp Med 191: