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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss der Spermagewinnungsmethode auf die Spermaqualität von Ebern und die Produktionseffizienz in Besamungsstationen INAUGURAL DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) Vorgelegt von Cord Lellbach geb. in Schweinfurt Hannover 2008

2 2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Detlef Rath, Institut für Nutztiergenetik, Mariensee (FLI) 1. Gutachter: Prof. Dr. Detlef Rath 2. Gutachter: Prof. Dr. Dagmar Waberski Tag der mündlichen Prüfung: Diese Arbeit wurde gefördert von der Dr. Dr. h.c. Karl Eibl Stiftung und dem Förderverein Biotechnologieforschung (FBF).

3 3 Teilergebnisse dieser Arbeit wurden auf der 6 th International Conference On Boar Semen Preservation unter dem Titel: Effects of automated collection methods on semen quality and economic efficiency of boar semen production (C. LELLBACH, C. LEIDING, D. RATH, B. STÄHR) präsentiert.

4 4 Meiner Familie

5 5

6 6 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 10 2 Literatur Das Ejakulat des Ebers Frequenz der Spermagewinnung Möglichkeiten der Gewinnung von Ebersperma Historischer Rückblick Das Sexualverhalten des Ebers als Grundlage der 19 Spermagewinnung Rückgewinnung des Spermas aus dem weiblichen Genitale Spermagewinnung mittels Phantomen Künstliche Vaginen Handmethode Einfluss der Gewinnungsmethode auf Menge und Qualität des 27 Eberspermas 2.5 Keimeintrag in das Sperma Fraktioniertes Auffangen des Ejakulats zur Keimzahlreduzierung Spermauntersuchung Makroskopische Untersuchung (Farbe, Geruch, Volumen) Spermienkonzentration Mikroskopische Untersuchungen Mikroskopisches Schätzverfahren Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) Morphologie Durchflusszytometrie Prinzip der Messung Lipidperoxidation 41

7 Bodipy/PI-Färbung DCFH/PI-Färbung DHR/PI-Färbung 44 3 Material und Methoden Material Technische Einrichtung zur Versuchsdurchführung Versuchstiere Methoden Durchführung der Spermagewinnung, Gruppenbildung 47 Rotation der Gewinnungsmethode Methodenspektrum zur Beurteilung von Menge und Qualität 50 der Ejakulate Arbeitszeitstudien zur Ermittlung des Arbeitsaufwandes für 58 die verglichenen Methoden Verfahren zur ökonomischen Bewertung Statistische Auswertung 61 4 Ergebnisse Akzeptanz der Spermagewinnungsmethode durch die Versuchstiere Ejakulatsvolumen, Spermienkonzentration und Spermienmotilität 63 im nativen Sperma unter Berücksichtigung der Gewinnungsmethode (Messung im Labor der Eberstation) Ejakulatsvolumen Spermienkonzentration Spermiengesamtzahl Spermienmotilität im nativen Sperma Spermienmotilität im konservierten Sperma Spermienmorphologie 72

8 Flowzytometrische Untersuchung nach 73 PI/Rhodamin123-Färbung Akrosomintegrität Mikrobielle Befunde im Sperma unter Berücksichtigung der 76 Gewinnungsmethode Keimzahlen Keimarten Ökonomische Bewertung Arbeitszeitbedarf Kosten der Materialien Stückkosten je produzierte Spermaportion 84 5 Diskussion Handhabung der Methoden Ejakulatsvolumina, Spermienkonzentration, Spermiengesamtzahl Mikrobiologische Untersuchungen Morphologie, Plasmatropfen, PI / Rhodamin Motilität Ökonomische Bewertung der verschiedenen Methoden 94 6 Zusammenfassung 96 7 Summary 98 8 Literaturverzeichnis Anhang 112

9 9 Abkürzungen Abb Abbildung AC Artificial Cervix Ak Arbeitskraft Bodipy Dipyrrhomethene Boron Difluoride BTS Beltsville Thawing Solution CASA Computer assisted Sperm Analysis CCD charge coupled device DCFH Dichlorofluoreszin DHR Dihydrorhodamin DNA Desoxyribonukleinsäure h Stunde(n) KbE Kolonie bildende Einheit(en) KV künstliche Vagina lin linear L-L lower level log logarithmisch LPO Lipidperoxidation ml Milliliter Mot Motilität MW Mittelwert NaCl Natriumchlorid PI Propidiumjodid ± SD Standardabweichung Prog Progressivität R123 Rhodamin 123 ROS Reactive Oxygen Species SGZ Spermiengesamtzahl Tab Tabelle v.chr. vor Christus

10 10 1. Einleitung Brauchbare Methoden der Spermagewinnung beim Eber stellen eine entscheidende Voraussetzung sowohl für die Anwendung der künstlichen Besamung beim Schwein als auch für die Effizienz einer Besamungseberstation dar. Neben der Qualität des Spermas spielen zunehmend auch ökonomische Aspekte wie etwa die Verringerung der Kosten und Senkung der Arbeitszeit sowie des Materialaufwandes eine Rolle. In der Vergangenheit wurden zahlreiche Methoden angewendet, Eberejakulate zu gewinnen, von denen nur wenige Eingang in den Routinebetrieb fanden. Bei der Prüfung und Beurteilung eines Verfahrens zur Gewinnung von Ebersperma sind folgende Aspekte zu berücksichtigen: Die Methode soll einfach und ohne störende Einflüsse auf die Libido des Vatertiers sein. Das gesamte Ejakulat soll möglichst ohne Verschmutzung gewonnen werden. die Vitalität der Spermien muss erhalten bleiben und die Zahl der lebenden Spermien soll in vollem Umfang der Spermienzahl von Ejakulaten aus dem Natursprung entsprechen. Die Gewinnung soll möglichst einfach in der Handhabung sein. Alle Geräte, die mit dem Sperma in Kontakt kommen, müssen leicht zu reinigen sein und dürfen nicht aus für Spermien toxisch wirkendem Material bestehen. Da beim Eber relativ hohe physiologische Schwankungen in der Qualität und Quantität des Spermas auftreten, ist besonders darauf zu achten, dass diese Schwankungen nicht durch Faktoren, wie die Spermagewinnungstechnik zusätzlich erhöht werden. Dazu zählen neben der Gewinnungsmethode auch solche Faktoren wie Lärm, grelles Licht, fremdes Personal und unzureichende hygienische Verhältnisse. In Deutschland wird Ebersperma zum überwiegenden Teil mit der Handmethode gewonnen. Vorteile gegenüber der Gewinnung mit der künstlichen Vagina sind eine

11 11 geringere Keimzahl in den Ejakulaten, verbesserte Konservierbarkeit des Spermas, Möglichkeit der fraktionierten Spermagewinnung und Einsparung von Material und Kosten. Neben den bisher bekannten Methoden der Spermagewinnung gibt es in letzter Zeit Bestrebungen, die Spermagewinnung rationeller zu gestalten und damit in den arbeitstechnischen Spitzenzeiten der Spermagewinnung eine hohe Effektivität zu gewährleisten. Dazu zählen die Systeme Collectis der Firma Genes Diffusions und Automate der Firma Minitüb, die die permanente Anwesenheit einer Person während der Samenentnahme nicht mehr erforderlich machen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die beiden neuen halbautomatischen Methoden der Spermagewinnung mit der sog. die Handmethode zu vergleichen. Dabei sollten spermatologische Parameter erfasst und bewertet werden und gleichzeitig ökonomische Aspekte analysiert werden. Besonderes Augenmerk galt dabei der Effizienzsteigerung und Kostenminimierung der Ejakulatgewinnung. 2. Literatur 2.1 Das Ejakulat des Ebers Die unbehandelte Gesamtmenge eines Spermaergusses bezeichnet man als Ejakulat (WIESNER u. RIBBECK, 2000). Es besteht aus einem zelligen Anteil, sowie aus dem Seminalplasma. Der zellige Anteil enthält neben den komplett ausdifferenzierten Spermien auch unreife Vorstufen, abgestoßene Epithelzellen und Leukozyten (SCHNOOR, 1996). Das Seminalplasma besteht beim Eber aus den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen Prostata, Samenblasendrüsen und der Bulbourethraldrüsen. Hinzu

12 12 kommen in geringem Grad Sekrete aus den samenabführenden Wegen (ROTHE, 1963). Der Ejakulationsvorgang läuft in mehreren Phasen ab, bei dem verschiedene Spermafraktionen abgegeben werden: Die Vorphase wird von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen produziert und hat eine wässrige Konsistenz. Das Vorsekret kann Keime enthalten. Ihr schließt sich die Hauptphase an, in welcher die spermienreiche Fraktion strahlartig abgegeben wird. In der letzten, mitunter auch schon in Teilen der Vorphase des Ejakulationsvorganges, wird das Bulbourethraldrüsensekret abgesondert (BUSCH et al., 1982). Die Menge des Ejakulats ist relativ großen physiologischen Schwankungen unterworfen. In der Literatur findet man Angaben, die zwischen 50 und 1000 ml schwanken (BUSCH, 1991; KVASNICKIJ, 1963; GÖTZE, 1949; STÄHR u. WABERSKI, 2003). Ein durchschnittliches Ejakulat hat ein Volumen von ca. 200 bis 250 ml (STÄHR u. WABERSKI, 2003; ROTHE, 1963). Allerdings stellte ROTHE (1963) bereits fest, dass auch die Spermagewinnungstechnik einen Einfluss auf die Menge des Ejakulats hat. So erzielte er bei Verwendung von Phantomen, die den Anforderungen der Eber optimal entsprachen im Vergleich zu Primitivphantomen größere Ejakulatvolumina. Hier muss allerdings erwähnt werden, dass die Spermiengesamtzahl konstant blieb, so dass ein auf die Bedürfnisse des Ebers abgestimmtes Phantom zu höherer Sekretionsleistung der akzessorischen Geschlechtsdrüsen führte. Auch die Konzentration des Spermas variiert. Sie wird von äußeren Faktoren wie der Haltung, Fütterung und auch der Technik der Spermagewinnung beeinflusst. Auch hier findet man in der Literatur große Schwankungsbreiten, die von 1,5 bis 300 Milliarden Spermien pro Ejakulat reichen (ROTHE, 1963; BUSCH et al., 1991; GÖTZE, 1949; LOGUE u. GREIG, 1987)). Als mittleren Wert findet man eine Konzentration von 0,3 (0,1 bis 1,2) Millionen pro µl (BUSCH et al., 1991; STÄHR u. WABERSKI, 2003). Daneben spielen jahreszeitliche Schwankungen, sowie genetische Faktoren eine bedeutende Rolle (BUSCH et al., 1991). So stellte WICKE (1991) in ihren Untersuchungen zum Spermaproduktionsvermögen signifikante Beziehungen zur Ho-

13 13 denentwicklung bei Jungebern fest. Die Hodengröße am 100. und 140. Lebenstag steht demnach in signifikant positiver Korrelation sowohl zur Spermienkonzentration als auch zur Spermiengesamtzahl je Ejakulat. Die durchschnittliche Spermiengesamtzahl eines Eberejakulats liegt bei 60 Milliarden Spermien (STÄHR u. WABERSKI, 2003). Zum ph Wert finden sich Angaben, die zwischen 6,6 und 7,9 schwanken (GÖTZE, 1949; BUSCH et al., 1991; ROTHE, 1963). In originärem Ebersperma sollten mindestens 75 % der Spermien vorwärtsbeweglich sein und höchstens 25 % morphologische Veränderungen (einschließlich Plasmatropfen) aufweisen (STÄHR u. WABERSKI, 2003).

14 14 Tab. 1: Mittelwerte verschiedener Parameter von nativem Ebersperma nach verschiedenen Autoren Merkmal STÄHR u. WABERSKI, 2003 BUSCH et al., 1982 GÖTZE, 1949 ROTHE, 1963 Farbe milchig weiß (weiß milchig weiß milchig weiß weiß graugelb grau-weiß) (weißgrau gelbweiß) Konsistenz milchig (wässrig mil- milchig (wässrig wässrig (tropfbar mit wässrig milchig chig) milchig) stärkekleisterähnlichen, groben Flocken) Beimengungen keine Volumen (ml) 200 (50 600) 200 (50 500) 200 ( ) 100 (10 850) Konzentration (106/µl) 0,300 (0,100 1,200) 0,3 (0,1 1,0) 0,1 0,4 (0,05 1,0) 0,13 0,93 Spermiengesamtzahl (10 9 /Ejakulat) 60 (10 180) 60 (2 200) (1,5 300) 2,7 300 Motile Spermien (%) 75 (0 90) 60 (0 80) k.a Morphologisch abweichende Spermienformen(%) 15 (5 80) 15 (5 50) 5 20 k.a Spermien mit Plasmatropfen (%) 10 (5 60) 10 (2 40) (4,6 9,6)

15 15 Ejakulate, die mehr als 15 % Spermien mit Plasmatropfen enthalten (siehe Punkt 2.3.) sollten nicht für den Besamungseinsatz verwendet werden (WABERSKI et al., 1994; ALTHOUSE, 1998). 2.2 Frequenz der Spermagewinnung In den 60er Jahren war man der Meinung, dass von einem adulten Eber 5 bis 6 mal pro Woche Sperma gewonnen werden kann, ohne eine Einbuße in Spermaqualität zu verzeichnen (KVASNICKIJ, 1963). Dem widersprechen allerdings Angaben von Götze (1949), wonach Eber mindestens 36 bis 48 Stunden Ruhepause benötigen, um Sperma mit gleich bleibend hoher Qualität zu produzieren. Busch et al. (1982) schlussfolgerten unter Zugrundelegung von Untersuchungen von MUDRA und CONRAD (1980), dass bei der unterschiedlichen Sexualpotenz der E- ber Erholungspausen zwischen 4 und 6 Tagen zu einer optimalen Spermaqualität führen. Diese Ergebnisse bestätigen auch neuere Untersuchungen, wonach 6 bis 8 Ejakulate je Monat als optimal angesehen werden. Größere Ruhephasen führen demnach nicht zu höheren Zahlen ejakulierter Spermien, weil die Verluste durch unkontrollierten Abgang dann offensichtlich zunehmen (STÄHR, 2005). Neuere Besamungsversuche zeigten, dass mit steigender Häufigkeit der Spermagewinnung pro Woche (ein- bis siebenmal) die Wurfgröße der Sauen abnimmt (FRA- GENZ et al., 2005). Die Autoren führten dies darauf zurück, dass sich bei erhöhter Frequenz der Spermagewinnung die Sekrete der Samenblasendrüsen in ihrer Zusammensetzung verändern und erschöpfen.

16 16 Im Gegensatz dazu zeigten Versuchen von PRUNEDA et al. (2005) dass bei höherer Frequenz der Spermagewinnung die Zahl der deformierten und sich abnorm bewegenden Spermien steigt Ein wichtiges Kriterium, von dem man auch die Häufigkeit der Spermagewinnung abhängig machen kann, sind die Plasmatropfen, welche am Mittelstück des Spermiums entweder proximal oder distal anzutreffen sind. Sie stellen mit einem Anteil von 74 % aller Fehlformen den größten Teil an morphologischen Abweichungen dar (BACH et al., 1982). Ihre negativen Beziehungen zur Konzeptionsrate und Wurfgröße sind mehrfach nachgewiesen worden (STÄHR u. WABERSKI, 2003), wobei ihre Anwesenheit auf eine gestörte Nebenhodenpassage und die damit verbundenen Schädigungen für die Spermien hinweist (STÄHR, 2001). So stellte sich in Versuchen von PRUNEDA et al. (2005) heraus, dass die Zahl der Spermien mit Plasmatropfen bei steigender Absamhäufigkeit zunimmt. Dies ist auf die verkürzte Aufenthaltszeit der Spermien im Nebenhoden zurückzuführen, wo sie normalerweise 9 bis 14 Tage verweilen müssen, um befruchtungsfähig zu werden. A: Spermienzelle mit proximalem Zytoplasmatropfen B: Spermienzelle mit distalem Zytoplasmatropfen C: Spermienzelle mit Schleifenbildung D: freie Zytoplasmatropfen aus LOVERKAMP et al., 2005 Abb. 1: morphologische Abweichungen von Spermien

17 17 Die Häufigkeit der Spermagewinnung wirkt sich auch auf den ph Wert aus: so fanden YEN et al. (1984) bei ihren Untersuchungen zu Intervallen der Spermagewinnung beim Eber bei 48-stündigem Abstand einen ph von 8,01, wohingegen der ph- Wert bei wöchentlich nur einer Spermagewinnung 7,63 betrug. Heute geht man davon aus, dass man von einem Eber dreimal pro Woche Sperma gewinnen kann, ohne eine signifikante Beeinträchtigung der Qualität befürchten zu müssen (Internet Agrarnet : Landwirtschaftskammer Österreich; LOVERKAMP, 2005). Ähnliche Ergebnisse publizierten auch schon LOGUE und GREIG (1987), indem sie eine mindestens 48 stündige Ruhepause zwischen zwei Ejakulatgewinnungen empfahlen. 2.3 Möglichkeiten der Gewinnung von Ebersperma Historischer Rückblick Historische Überlieferungen, in denen erstmals die künstlicher Besamung beschrieben wird, gehen auf die Zeit um 800 v. Chr. zurück. Damals sollen die Assyrer bereits Tiere und Pflanzen künstlich besamt haben. Im 14. Jahrhundert soll es laut einer Sage einem Araberhäuptling gelungen sein, Sperma eines Araberhengstes mit einem Haarbüschel in die Scheide einer Stute einzubringen, sodass das Tier gravid wurde (Götze, 1949). Im Jahre 1677 entdeckte Antonio van Leuwenhoeck mithilfe eines Mikroskops erstmals die damals noch so genannten Samentierchen oder auch vermiculi minutissimi, womit sie seitdem Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen wurden (BETTENDORF, 1998).

18 18 Auch in der Humanmedizin wurden Versuche zur künstlichen Besamung unternommen, allerdings durch ein päpstliches non licere 1897 an Frauen verboten und als unmoralisch abgetan. Lange wurde in der Tierzucht nach Methoden gesucht, die geeignet waren, den Zuchtfortschritt bei landwirtschaftlichen Haustieren zu beschleunigen. Erste Berichte über Experimente mit biotechnischen Methoden in der Tierzucht sind bereits 200 Jahre alt. Im 18. Jahrhundert gelang es dem italienischen Priester Lazzaro Spallanzani, die künstliche Besamung bei einer Hündin durchzuführen. Damit konnte er beweisen, dass es möglich ist, auch ohne natürliche Paarung Nachkommen zu erzeugen. Ein gezielter Einsatz der künstlichen Besamung in der Haustierzucht wurde aber erst Anfang des letzten Jahrhunderts möglich und wurde bei Haustieren vor allem in Russland und Dänemark erforscht. Hier entstanden auch die ersten Besamungsstationen und erzielten beachtliche Erfolge (GÖTZE, 1949). Die weitere Entwicklung und Verbreitung der künstlichen Besamung wurde durch den 2. Weltkrieg unterbrochen. Danach erlebte die künstliche Besamung einen großen Aufschwung. Bis dahin gab es in den meisten Gemeinden Deckbullen, was zur ungehinderten Ausbreitung von Deckseuchen führte. Verhindert werden konnte dies erst durch die Einführung der künstlichen Besamung, bei der nur noch Bullen zum Einsatz kamen, deren Sperma und Gesundheit regelmäßig tierärztlich überwacht werden (MAUTE, 2003), und außerdem den Besamungsportionen Antibiotika entsprechend den gültigen EU-Reglungen zugesetzt werden. Beim Schwein wird die künstliche Besamung hauptsächlich mit Frischsperma durchgeführt. Man erhält durchschnittlich 30 Portionen mit 2 Milliarden Spermien pro E- berejakulat. Laut Informationen des Zentralverbandes der Deutschen Schweineproduktion (ZDS) wurden 2005 etwa 90 % der 2,5 Millionen Zuchtsauen künstlich besamt; dazu wurden über 5,5 Millionen Doppelportionen Ebersperma verkauft. Knapp 80 % der Porti-

19 19 onen stammten von Pietrainebern. Dabei kam fast ausschließlich flüssigkonserviertes Sperma zum Einsatz Das Sexualverhalten des Ebers als Grundlage der Spermagewinnung Der Deckakt stellt beim Eber, ähnlich wie bei anderen Haussäugetieren, einen Ablauf von Reflexhandlungen dar (BUSCH et al., 1991; BUSCH u. WABERSKI, 2007). Während in der ersten Phase visuelle Reize genügen, um das Vorspiel (Excitatio) auszulösen, sind für den Ejakulationsprozess taktile Reize und Temperaturen von 35 bis 41 C nötig (GÖTZE, 1949). Hier sei auch der sog. Torbogenreflex erwähnt, der dadurch zu erklären ist, dass die Silhouette einer Sau von hinten betrachtet einem Torbogen ähnelt. Dieses Prinzip wird sich auch bei der Konstruktion von Phantomen zur Spermagewinnung zunutze gemacht, deren Ursprung die Verwendung einer gut rauschenden Sau als Sprungpartner war, die mittels eines Zwangsstandes oder einer Oberkieferschlinge fixiert wurde (ROTHE, 1963). Zunächst erfolgt die Kontaktaufnahme mit Grunzen und Schaumschlagen, welches durch gegeneinander versetzte Reibebewegungen der Kiefer entsteht. Daneben erfolgt intensives Beschnüffeln und in die Flanke schlagen mit dem Rüssel. Durch dieses Verhalten markiert der Eber seinen Deckpartner. Hierbei kommt es meist schon zur Erektion (Erektio) mit Ausschachten (Emissio) des Penis und anschließendem Aufsprung (Ascensus), der häufig zunächst von der Seite beginnt und dann schnell zum Hinterteil der Sau wechselt. Nach dem Einnehmen der für den Deckakt typischen Position erfolgt die Suchphase (Adjustatio) in welcher der Penis in die Vagina der Sau eingeführt wird. Ihr folgen mehrere starke Friktionsbewegungen (Frictio), wobei der Penis endgültig ausgeschachtet und erigiert in die Zervix geschoben wird. Es schließt sich die eigentliche Ejakulation (Ejakulatio) an, in der der Eber fast bewegungslos bis zum Ende auf der Sau verweilt.

20 Rückgewinnung des Spermas aus dem weiblichen Genitale Bis zum Jahre 1914 beschränkte sich die Samenübertragung darauf, Ejakulate aus der Scheide von Pferden, Rindern und Schafen mithilfe von Schwämmen wieder aufzufangen und diese anderen Tieren anschließend in die Gebärmutter zu einzusetzen. Diese Methode war allerdings wenig erfolgreich und so wurde bis zum Jahre 1930 der Durchführung der künstlichen Besamung kaum Beachtung geschenkt (GÖTZE, 1949). In den zwanziger Jahren des 20. Jahrhunderts wurden in Russland Gummibeutel entwickelt, die dem weiblichen Tier ins Genitale eingesetzt wurden und am offenen Ende eine aus hartem Gummi verstärkte Platte enthielten, welche die Scham bedeckte und Verschmutzungen durch Kot abhalten sollte (GÖTZE, 1949). Nachteile dieses Verfahrens waren, dass die Beutel oft durch die Friktionsbewegungen des männlichen Tieres zerrissen wurden und dass große Teile des Ejakulats bei der Entnahme des Beutels aus der Scheide bereits abflossen Das Phantom als sexueller Ersatzpartner Für die Gewinnung von Ebersperma hat sich die routinemäßige Verwendung eines Phantoms als Paarungspartner als vorteilhaft erwiesen. Bezüglich künstlicher Vaginen und Phantome hat es zwischen 1950 und 1960 eine Reihe von Entwicklungen und Modellen gegeben. Einen Überblick lieferte ROTHE (1963). SMIDT (1965) und ROTHE (1963) stellen an die bauliche Gestaltung eines Eberphantoms zur Nutzung in einer Besamungsstation folgende Anforderungen: Anerkennung als Geschlechtspartner durch den Eber Starke präkopulatorisch stimulierende Wirkung

21 21 Anpassungsmöglichkeit an die Größe des Ebers Leichte Reinigung und Desinfektion Seitlich flache Vorsprünge am Phantom, die den Hüfthöckern der Sau entsprechen einfache und stabile Konstruktion Die Dauer des Ejakulationsvorganges wird vom Alter, der Rasse und der individuellen Veranlagung des Ebers, seiner sexuellen Stimulation und der angewandten Methode der Spermagewinnung beeinflusst. Entsprechend des Paarungsverhaltens der Eber beim natürlichen Deckakt müssen daher auch bei der Spermagewinnung die Schlüsselreize für den Ablauf der Reflexkette sichergestellt werden. Auch sollten die Umweltbedingungen konstant gehalten werden, da sie die Ejakulationsdauer beeinflussen können (WERMUTH 1968). ROTHE (1963) gab für Schweinephantome folgende Maße an: Länge 90 cm, Breite 30 cm, Höhe 60 cm, Höhe der Einsprungöffnung vom Boden (soweit eine Künstliche Vagina eingesetzt wird) 40 cm. Hieraus wurden verschiedene Phantome entwickelt, welche als Grundlage der gegenwärtig in Besamungsstationen verwendeten Phantome angesehen werden können. Das Berliner Phantom II bestand aus einem hölzernen Grundkörper. Die Rückenfläche bot genügend Auflagefläche und war mit einer Schaumgummipolsterung versehen, die wiederum mit einem Segeltuch oder einer Schweinehaut überzogen ist. Außerdem ist sie mit einer Kopfnachbildung versehen. Es wurde ausschließlich mit künstlichen Vaginen (KV) gearbeitet, so dass in diesem Phantom ein Vaginenschlitten existiert, in dem die KV fixiert wurde. Ein Wagenheber ermöglicht die Regulierung der Höhe und somit die individuelle Anpassung an die Größe des Ebers (Abb. 2).

22 22 Abbildung 2 + 3: Berliner Phantom II (nach ROTHE, 1963) Eine Weiterentwicklung dieses Phantoms stellte das Leipziger Phantom dar. Dies verfügte über ein stählernes Grundgerüst, bei dem durch 2 Motorradstoßdämpfer ein federnder Effekt der hinteren Phantomhälfte bewirkt wurde. Zwei seitliche Wülste gaben dem Eber Halt. In der UdSSR wurden Phantome entwickelt, die ebenfalls die Verwendung einer KV vorsahen. KVASNICKIJ und KONJUCHOVA (1963) konstruierten ein mit Glühlampen

23 23 beheizbares Phantom, so dass die KV während der Spermagewinnung gewärmt werden konnte (Abbildung 4). Abb. 4: Beheiztes Phantom mit künstlicher Vagina (nach KVASNICKIJ und KONJUCHOVA, 1963) Andere Konstruktionen bestanden aus einem ungepolsterten, hölzernen Sprungtisch (NIWA,1959; SCHAETZ, 1963), besaßen eine ferngesteuertes Ölwinde um die Höhe zu verstellen (KVASNICKIJ,1972), oder waren mit einer Polsterung versehen, um Verletzungen des Brustbeines zu vermeiden. Eine einfachere Ausführung eines Phantoms beschreiben AAMDAL und HÖGSET (1957). Sie bauten eine bankähnliche Konstruktion, die mit Plastik aufgepolstert und mit Segeltuch überspannt wurde. Die hinteren Stützen waren in der Höhe verstellbar. Durch diese Bauweise wurde es dem Techniker ermöglicht, freien Zugang zum Penis des Ebers zu bekommen. Abb. 5: Japanischer Sprungtisch für Eber (nach SCHAETZ, 1963)

24 24 Entsprechend der Angaben von WERMUTH (1968) und SCHMIDT (1971) wurden Phantome und künstliche Vaginen modifiziert nach AAMDAL für die Spermagewinnung entwickelt. KNAUS und HÖCHTL (1970) berichteten über die Verwendung von einfachen Metallphantomen mit Schaumgummipolsterung und einem Überzug aus Schweinehaut. In den USA und Kanada kommen beidseitig benutzbare, höhenverstellbare Phantome im Einsatz, die mit Segeltuch bespannt werden (MACPHERSON et al., 1970). Sie entsprechen in der Grundform dem von AAMDAL entwickelten Phantom. KOLITSCH und STÄHR (1977) entwickelten ein Phantom, das unter der Bezeichnung Schönow eine starke Anwendung in den Besamungseberstationen der DDR fand. Es handelte sich um eine Stahlrohrkonstruktion mit auswechselbarer, lederbezogener Schaumstoffpolsterung und verstellbaren Fußstützen (Abbildung 6). Abb. 6: Phantom Modell Schönow (nach KOLITSCH, STÄHR, 1977) Künstliche Vaginen Bereits im Jahre 1914 erfand der italienische Forscher Amantea die erste künstliche Scheide für Hunde, der Amerikaner Mc Kenzie versuchte die Samenentnahme mit Hilfe eines Samenfängers beim Eber (ROTHE, 1963) (Abbildung 7). Somit wurde die bis dahin gängige Methode der Samenrückgewinnung mittels Schwämmen erst-

25 25 mals durch einfache künstliche Vaginen ersetzt. Eine Vorreiterrolle spielte die russische Schafzucht, gefolgt von Dänemark in der Rinderzucht (GÖTZE, 1949; BUSCH et al., 1982). AAMDAL (1957) entwickelte die für Bullen verwendete künstliche Vagina für Eber weiter, mit dem Ziel, die keimreichen Beimengungen aus dem Diverticulum praeputiale zu minimieren und keimarme Ejakulate zu gewinnen. Durch ein 18 cm langes Vaginenrohr wurden zwei Schläuche gezogen, die einen inneren, wassergefüllten und einen äußeren, luftgefüllten Raum bildeten. Über die Öffnung wurde ein mit Antiseptikum getränkter Schaumgummi mit y-förmiger Öffnung zur mechanischen Reinigung des Penis gezogen. Künstliche Vagina und Auffanggefäß wurden durch einen Schlauch mit Abflussöffnung verbunden. Der Operateur umfasste diesen Schlauch und übte auf den Penis die ejakulationsauslösenden Druckreize aus (Abb. 8). Abb. 7: Samenfänger nach MC KENZIE (1931) Abb. 8: Ebervagina nach AAMDAL auf Halteschiene mit Auffangglas für Sperma (1958)

26 26 EIBL, ZODER und HAHN (1962) modifizierten die Methode nach AAMDAL. Das Ejakulat wurde mittels eines Glastrichters aufgefangen und nach sofortiger Filtration in einem Polyäthylenbeutel gesammelt. Mit diesem Vaginenmodell Neustadt/Aisch wurden im Vergleich zum Modell AAMDAL keimärmere Ejakulate gewonnen. In der Sowjetunion wurden verschiedene Typen von Metallvaginen mit einem Innenschlauch aus Gummi oder elastischen Vagineneinsätzen aus Gummi entwickelt (Abb. 9). Die Temperierung der KV erfolgte elektrisch oder durch Wasser (KVASNICKIJJ, 1962). Abb. 9: Heizbare Vagina mit Pulsator nach KVASNICKIJ (1963) Verschiedene Vaginen sind mit Metall- oder Plastikspiralen in oder an die Vagina anschließend ausgestattet, um durch das Eindrehen des Penis in die Spirale den ejakulationsauslösenden Druckreiz zu erzeugen (ROTHE, 1963; SMIDT, 1965). Solche Vaginen mit einer Länge von 15 cm und einer spiraligen Verlängerung wurden v.a. in Besamungsstationen in England eingesetzt (REED, 1969). LOGVINOV und KOSEVOI (1972) konstruierten ein Gerät zur keimarmen Gewinnung von Ebersperma. Es besteht aus einer verkürzten Bullenvagina mit eingelegter Plastikspirale, einem Aufsatz für die KV und einem verschließbaren Spermaauffanggefäß. Ein an der Wand des Aufsatzes angebrachtes, 50 ml fassendes Auffangbehältnis nimmt die zu Beginn der Ejakulation abgesetzte, keimreiche Fraktion auf.

27 Handmethode Die Spermagewinnung am Phantom erfolgt im einfachsten Fall ohne Hilfsmittel durch Umfassen der spiraligen Penisspitze. Unter Verwendung eines Einmalhandschuhs wird mit der Hand Druck auf die Penisspitze ausgeübt. Die Anwendung dieser Methode für die fraktionierte Spermagewinnung ist aus Japan bekannt. Von der Spermagewinnung per Hand in Stationen in England berichtetet REED (1969). Auch in Kanada und in Ungarn fand diese Methode Anwendung (MACPHERSON et al., 1970). Wichtig ist eine vorherige Erwärmung des Auffanggefäßes, um das Ejakulat möglichst temperaturgleich zu gewinnen. Außerdem muß es nach Beendigung der Ejakulation unverzüglich mit einer Temperatur von mindestens 31 C das Labor erreichen, da es unverdünnt sehr empfindlich auf Temperaturschwankungen reagiert (BUSCH, 2007). Das Risiko der Kontamination durch Staub, Schuppen oder Schmutzpartikel ist bei der Handmethode größer als bei der Verwendung von künstlichen Vaginen, da sich das offene Gefäß unter bzw. direkt neben dem Eber befindet. Trotzdem hat sich die Handmethode auf Besamungseberstationen durchgesetzt und ist die derzeit am meisten verbreitete Methode um Ebersperma zu gewinnen. 2.4 Einfluss der Gewinnungsmethode auf die Menge und Qualität des Eberspermas Bei Anwendung der Handmethode ermittelten KING und MACPHERSON (1973) signifikant höhere Spermienzahlen im Ejakulat. Auch CONRAD et al. (1992) fanden im Vergleich zwischen der Spermagewinnung durch die Handmethode gegenüber der Gewinnung mit Hilfe der künstlichen Vagina signifikant höhere Ejakulatmengen und führten das auf eine bessere Stimulierung des Ebers zurück.

28 28 Versuche mit unterschiedlich dickem Plastikmaterial als Innenschläuche für die KV führten auch unter Verwendung von sehr feinen Wanddicken (0,03 mm) nicht zu höheren Volumina. Die Autoren schlussfolgerten, dass Plastikmaterialien beim Eber nicht das Kontaktgefühl mit der Vaginalschleimhaut vortäuschen können. 2.5 Keimzahlen und Keimarten in Abhängigkeit der Gewinnungsmethode sowie technische Möglichkeiten der Keimzahlreduzierung Die Hygiene vor und während des Vorganges der Spermagewinnung spielt eine bedeutende Rolle, da der Anfangskeimgehalt die Konservierbarkeit des Spermas direkt beeinflusst (BUSCH et al., 1969). So ergaben Untersuchungen von KOZUMPLIK (1975) und DIAS et al. (2000), dass zum einen das regelmäßige Waschen der Eber sowie das Reinigen des Penis vor der Spermagewinnung einen wesentlichen Beitrag zur Minimierung des Keimgehaltes der Ejakulate liefern. Beim Vergleich der Spermagewinnung per Hand, mit künstlicher Vagina und mit künstlicher Vagina und einer Scheidewand aus Polyurethan vor der Einsprungöffnung stellten BONADONNA et al. (1972) den geringsten Keimgehalt in den mit der letztgenannten Methode gewonnenen Ejakulaten fest. Ebenso gelang eine Reduzierung des Keimgehaltes mit einer KV, die mit einem Diaphragma aus Polyäthylen an der Einsprungöffnung ausgestattet war. KOZUMPLIK (1975) hingegen kam zu gegenteiligen Ergebnissen, wonach er mit künstlichen Vaginen im Durchschnitt Keime/ml und bei der Handmethode Keime/ml ermittelte. Der Keimeintrag muss an verschiedenen Punkten der Spermagewinnung sowie verarbeitung geschehen, da in den Hoden eines gesunden Ebers Sperma unter keimfreien Bedingungen produziert wird. Die anschließende Reifung und Lagerung des Spermas im Nebenhoden findet ebenfalls unter keimfreien Bedingungen statt.

29 29 Eine übersichtliche Gliederung der Keim-Eintragsfaktoren lieferten ALTHOUSE et al. (2000), indem sie zwischen eberassoziierten und nicht-eberassoziierten Kontaminationsquellen unterschieden. Zu ersteren gehören Haut, Haare, Sekrete aus dem Präputialdivertikel sowie Fäkalien. Auch auf der Schleimhaut des Penis finden sich Keime, wie FOLEY et al. (1971) in ihren Versuchen mit 11 Ebern herausfanden. Nicht eberassoziierte Eintragsquellen sind alle bei der Gewinnung und Verarbeitung des Spermas einwirkende Faktoren, angefangen bei Staub in der Stallluft, Niesen und Husten des Stallpersonals oder mangelhafte Handhygiene. Folgende Tabelle gibt einige der häufigsten unspezifischen Keime wieder, welche aus dem Sperma landwirtschaftlicher Nutztiere isoliert wurden: Tab. 2: Unspezifische Keime im Ebersperma Unspezifische Keime im Sperma Proteus spp. Arcanobacterium spp. Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Escherichia coli Streptococcus spp. Micrococcus spp. Hauptort für die Keimbesiedlung ist das Diverticulum praeputiale (ROTHE 1963, DAGNALL u. JONES 1985). Es zeigten sich jedoch Unterschiede zwischen den Eberlinien, als auch eine Abhängigkeit des Keimgehaltes vom Alter und der Nutzung des Tieres (ALTHOUSE et al., 2000). Die nachfolgende Tabelle gibt einen Überblick über einige Angaben bezüglich des Keimgehalts in nativem Ebersperma:

30 30 Tab. 3: Keimzahlen in Abhängigkeit von der Gewinnungsmethode (nach WEYAND, 2005) GKZ im nativen Sperma Gewinnungsmethode Autoren KV mit Diaphragma Bonadonna et al.. (1972) KV ohne Diaphragma Handmethode Handmethode DUBIEL et al.. (1981) Eber 1-2 J. alt kg Zuchteber Handmethode, vorher Penis SONE et al.. (1982) mit NaCl-Lösung abgespült Mio. Handmethode DAGNALL u. JONES (1985) Zuchteber; LW, EL 660-1,4 Mio. Handmethode CHANSILPA (1987) Zuchteber; PI, DL, LW ,41 Mio. Handmethode DANOWSKI (1989) Zuchteber GKZ = Gesamtkeimzahl

31 Fraktioniertes Auffangen des Ejakulats zur Keimzahlreduzierung In den 60-er Jahren wurden viele Versuche unternommen, die spermienreiche Fraktion separat zu gewinnen. Man maß dieser Art der Gewinnung große Bedeutung bei, da keimärmere Ejakulate gegenüber dem komplett aufgefangenen Ejakulat verbesserte Konservierungseignung besitzen (BUSCH, STREY, PÄPLOW, 1969). Bei der Gewinnung per Hand ist die Fraktionierung einfach durchführbar. Die spermienreiche Fraktion wird aufgefangen, sobald das Sperma sich deutlich weiß zu färben beginnt. KOLITSCH und STÄHR (1977) beschreiben die Fraktionierung auch mittels KV, indem unter ständiger visueller Kontrolle das Sperma mittels eines sich an die KV anschließenden Schlauches je nach Weißfärbung in verschiedene Gefäße geleitet wird. Von sowjetischen Autoren wurden mechanische Verfahren beschrieben, die es ermöglichten, verschiedene Spermienfraktionen aufzufangen. Die mechanische Vorrichtung im Phantom erinnert an ein Revolvermagazin mit Auffanggläschen: zum erforderlichen Zeitpunkt (bei Änderung der Farbe des Spermas) erfolgte durch Druck auf einen Knopf die Drehung des Revolvermagazins um 60 (KVASNICKIJ et al., 1963). Somit ließen sich 6 Fraktionen gewinnen; bei Bedarf, durch Auswechseln der Auffanggläschen, auch noch mehr. Bei den genannten Verfahren der Fraktionierung wurde das Bulbourethralsekret während der Gewinnung mittels eines Filters von dem Sperma getrennt. Die hierbei verwendeten Phantome waren mit Sichtfenstern zur visuellen Kontrolle versehen bzw. einige Modelle auch mit innerer Beleuchtung. In den 60er Jahren wurde auch ein Verfahren zur automatischen Trennung der Spermafraktionen entwickelt, was sich allerdings in der Praxis nicht durchgesetzt hat (KOLITSCH u. STÄHR, 1977). Aufgrund der unterschiedlichen Trübungsintensität der einzelnen Ejakulatphasen wurde durch eine Lichtschranke sowohl eine lichtdurchlässige als auch lichtundurchlässige Phase detektiert. Durch ein elektromagnetisch gesteuertes Ventil konnte das Ejakulat je nach Lichtdurchlässigkeit in 2 Phasen geteilt werden. Rund 77 % der Gesamtspermien konnten in Experimenten mit die-

32 32 sem System so in der weniger lichtdurchlässigen Phase gewonnen werden, der Verlust gegenüber der visuell kontrollierten Spermafraktionierung betrug 13 %. CONRAD (1973) verglich die Spermiengesamtzahlen, die sich mit fraktionierter Gewinnung erzielen ließen, mit denen, die sich durch die herkömmliche Spermagewinnung ergaben. Seine Untersuchungen ergaben, dass mit einem effektiven Spermienverlust von bis zu 10 % bei Anwendung der fraktionierten Spermagewinnung gerechnet werden muss. 2.6 Spermauntersuchung Im Mittelpunkt des Interesses einer Besamungsstation steht die Produktion qualitativ hochwertigen Spermas, welches zu einer hohen Befruchtungsrate und somit einer hohen Nachkommenzahl führen soll. Bereits 1949 schildert GÖTZE erste detaillierte Untersuchungsmethoden, welche seit dem von vielen Autoren aufgegriffen und erweitert wurden. Das Hauptziel ist, mit Hilfe von In-vitro-Untersuchungen Prognosen über die Befruchtungsfähigkeit einer Spermaprobe treffen zu können und untaugliche Ejakulate zu eliminieren. Lange wurde versucht, die Qualität einer Spermaprobe von bestimmten Parametern abhängig zu machen. Dies erwies sich allerdings zum einen aufgrund der komplexen Vorgänge während der Befruchtung (also in vivo) und zum anderen aufgrund der vielen verschiedenen Definitionen des Begriffs Fruchtbarkeit als unmöglich (AMANN u. HAMMERSTEDT, 1993). Es ist darüber hinaus wichtig, dass sich Fertilitätsprognosen nicht nur auf In-vitro- Befunde stützen, da hier Schritte, welche in vivo ablaufen, völlig ausgeklammert werden (AMANN, 1989; WOELDERS, 1990; FOOTE, 2003; GADEA, 2005).

33 33 Eine völlig andere Herangehensweise an die Problematik zeigten BUSCH et al. (1991): so sollten das Fehlen oder die Veränderung bestimmter Spermacharakteristika zu Unfruchtbarkeit führen. Um eine gleich bleibend hohe Qualität des Spermas sicherzustellen, sind Mindestanforderungen zu Rate zu ziehen, die auf systematisch ermittelten Untersuchungen basieren (CHRISTENSEN et al., 2001). Um allerdings eine hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen der Laboruntersuchungen und der tatsächlichen Fertilität zu erzielen, ist es notwendig zum einen spezifische sowie reproduzierbare In-vitro- Untersuchungsmethoden zur Verfügung zu haben und zum anderen über präzise Ausgangsdaten bezüglich der Fruchtbarkeitsparameter zu verfügen. AMANN (1989) und WABERSKI et al. (1999) schlugen vor, verschiedene Tests zu kombinieren, um eine genauere Aussage bezüglich der Befruchtungsfähigkeit tätigen zu können. In der Literatur wurden bereits verschiedenste In-vitro-Parameter beschrieben, welche alle Einfluss auf die Qualität und damit die Befruchtungsfähigkeit des Spermas haben. Zu diesen Parametern existieren unterschiedlichste Methoden der Spermabeurteilung beispielsweise die Erfassung der Spermienmotilität, morphologischer Parameter, der Spermienkonzentration, der Akrosomintegrität, der Chromatinstuktur o.ä. Die Spermabeurteilung erfolgt mit folgende Methoden: makroskopisch (Ejakulatsvolumen, Farbe, Geruch, Konsistenz, Beimengungen), mikroskopisch (Morphologie, Spermienmotilität, Anteil von Fremdzellen, Agglutinationsgrad), mikrobiologisch (Bestimmung der Keimzahl und Verhinderung der Krankheitsübertragung) sowie biochemisch - physikalisch (ph- Wert, Osmoresistenz, Chromatinstruktur). In den letzten Jahren halten zusehends computergestützte Untersuchungsmethoden Einzug in die Routineuntersuchung von Sperma auf Besamungseberstationen.

34 Makroskopische Untersuchung (Farbe, Geruch, Volumen) Die Farbe des Ejakulates hängt ab von der Anzahl der Spermien pro Milliliter, der Beschaffenheit des Sekrets der akzessorischen Geschlechtsdrüsen sowie von etwaigen Beimengungen wie Schmutz, Blut oder Harn (BUSCH et al., 1991; BUSCH u. WABERSKI, 2007). Ebersperma soll weiß bis leicht weiß/gelbweiß sein (ROTHE, 1963; STÄHR, WABERSKI, 2003; BUSCH u. WABERSKI, 2007). Der Geruch originären Spermas ist bei allen Tierarten nahezu neutral. Veränderungen hierbei ergeben sich z.b bei fäkaler Verunreinigung oder Harn. Solche Befunde schließen die weitere Verarbeitung des Ejakulates aus. Das Volumen eines für die weitere Verwendung geeigneten Eberejakulates soll mindestens 90 bis 100 ml betragen (LOGUE u. GREIG, 1987; BUSCH et al., 1991; STÄHR u. WABERSKI, 2003) Spermienkonzentration Die Spermienkonzentration gibt die Anzahl der Spermienzellen pro Volumeneinheit an. Sie wird von genetischen Faktoren genauso beeinflusst wie von Umweltfaktoren z.b. Fütterung oder Technik der Spermagewinnung. Der routinemäßigen Bestimmung der Spermienkonzentration maßen BUSCH et al. (1991) große Bedeutung bei, da sich von ihr ausgehend die Anzahl der aus einem Ejakulat zu erstellenden Besamungsdosen berechnen lassen. BUSCH et al. (1991) und SCHMIDT (1963) fanden positive Korrelationen zwischen Spermienkonzentration und dem Befruchtungsergebnis. Die Konzentration eines Eberejakulates soll nach STÄHR und WABERSKI (2003) und BUSCH et al. (1991) mindestens 0, Spermien pro µl betragen. Zur Messung stehen folgende Methoden zur Auswahl:

35 35 Zählkammern Zählkammern z.b. nach Thoma neu oder das Neubauer Hämozytometer (HEMO), welche auch zur Auszählung von Blutkörperchen verwendet werden, liefern zwar sehr genaue Ergebnisse und gelten derzeit noch als Goldstandard (HANSEN et al., 2006), sind aber sehr arbeits- und zeitaufwendig in der Anwendung und daher für den Routinebetrieb einer Besamungsstation nicht geeignet. Photometer Das Prinzip des Photometers besteht darin, dass unter Zugrundelegung einer Eichkurve die Trübung einer in einem bestimmten Verhältnis verdünnten Lösung bestimmt wird. Bei Bullensperma wird nach Untersuchungen von MÜLLER und BRANDL (1978) das Ergebnis durch Seminalplasmaproteine nicht verfälscht, wohingegen bei Ebersperma eine Absorptionserhöhung durch diese Proteine das Messergebnis verfälschen kann (BUSCH u. WABERSKI, 2007). Eine regelmäßige Eichung des Gerätes vorausgesetzt, ist die photometrische Konzentrationsbestimmung jedoch ein zuverlässiges Hilfsinstrument im Routineeinsatz auf Besamungsstationen. Flowzytometer, Coulter Counter Bei der durchflusszytometrischen Untersuchung werden die Spermien mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und durch einen Flüssigkeitsstrom in einer Kapillare geleitet. Dieser Flüssigkeitsstrom wird einem Laserstrahl ausgesetzt. Das optische System des Durchflusszytometers nimmt die unterschiedlich fluoreszierenden Spermienzellen wahr, welche anschließend von einem Computer gespeichert und ausgewertet werden können. Die spezifische Anfärbbarkeit der Spermien mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen liefert sowohl Informationen über den funktionellen Habitus der Spermienzelle, z.b. über die Membranintegrität, die Chromatinstruktur oder den akrosomalen Status (GRAHAM et al. 1990, NAGY et al. 2002) als auch über die Konzentration des Ejakulates.

36 36 Auch das Prinzip des Coulter Counters basiert auf dem Prinzip der Messung in einem Flüssigkeitsstrom. Allerdings kommt hier im Unterschied zum Flowzytometer keine optische, sondern eine elektronische Detektionseinheit zum Einsatz. Mit beiden Geräten ist es möglich auf diese Weise ca Zellen innerhalb von Sekunden zu analysieren (STOLLA, 1984; GRAHAM et al. 1990). Nucleo Counter Das Gerät besteht aus einem Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer CCD- Kamera zur Mikroskopbildanalyse und entsprechender Software. Das Gerät ist ausschließlich zur Bestimmung von Zellkonzentrationen bestimmt. Die Zellmembran der Spermien wird durch eine spezielle Aufschlusslösung zerstört, der Zellkern freisetzt und die DNA mit Propidiumiodid angefärbt. Die Messprobe wird während der 30 Sekunden des Messzeitraumes durch die Kassettenkammer gesaugt, in deren Bereich auch die fluoreszenzmikroskopische Analyse der gefärbten Zellkerne erfolgt.

37 Mikroskopische Untersuchung Eine wichtige Voraussetzung für die Befruchtungsfähigkeit der Spermien stellt ihre Eigenbeweglichkeit dar (ROTHE, 1963; STÄHR 2003). Die Spermienmotilität stellt eine klassische Methode zur Beurteilung der Qualität einer sowohl verdünnten als auch unverdünnten Spermaprobe dar, da sie eine Vielzahl von Funktionen der Spermien voraussetzt. Somit lassen sich in einer Zahl mehrere Faktoren beschreiben, welche wichtige Kriterien für die Befruchtungskompetenz darstellen, etwa der Membranzustand, Energiestoffwechsel und die morphologische Unversehrtheit (STÄHR, 2001). Außerdem geht der Anteil motiler Spermien in die Berechnung des Verdünnungsgrades ein und bestimmt somit maßgeblich die Anzahl an Besamungsportionen, die aus einem Ejakulat hergestellt werden können. Entscheidend für die Beurteilung eines Ejakulates ist der Anteil der vorwärtsbeweglichen Spermien Mikroskopisches Schätzverfahren Die mikroskopische Schätzung der vorwärts,- orts- und unbeweglichen Spermien ist die am häufigsten zur Qualitätsbestimmung eines Ejakulates herangezogene Methode (GÖTZE, 1949; ROTHE, 1963; KVASNICKIJ, 1963; JUONALA et al. 1998; BUSCH u. WABERSKI, 2007). Dabei sind hohe Anforderungen an das Laborpersonal zu stellen; unvermeidbar sind hierbei große Variationsbreiten der Ergebnisse (IGUER-OUADA u. VERSTEGEN 2001). Die Durchführung dieses Verfahrens wurde bereits von vielen Autoren beschrieben (LOGUE u. GREIG, 1987; BUSCH et al., 1991; STÄHR, 2003). Ausgehend von der Problematik der großen Variationsbreiten, die durch das subjektive Schätzverfahren begründet sind, gab es Anfang der 80er Jahre des vergangenen Jahrhunderts erste Entwicklungen zur computerassistierten Spermaanalyse.

38 Computerassistierte Spermienanalyse (CASA) Computerassistierte Motilitätsanalyse Erste Systeme, die Spermienbewegungen digital aufbereiteten wurden bereits im Jahre 1978 von AMANN und KATZ vorgestellt. Mit Verbesserungen von Soft- und Hardware gelang es 1985 erstmals kommerziell nutzbare Systeme auf den Markt zu bringen. Diese Verfahren sind inzwischen so ausgereift, dass sie objektive Anhaltspunkte ü- ber die Qualitätseigenschaften der zu untersuchenden Spermaprobe liefern können. Soweit die korrekten Einstellungen am Computer bekannt sind und bei definiertem Umgang mit den zu untersuchenden Proben lassen sich gegenüber der Schätzmethode besser reproduzierbare Ergebnisse erzielen (VERSTEGEN et al. 2002). Bei der CASA wird dies durch die Verwendung von Software ermöglicht, die in der Lage ist in einem definierten Zeitabschnitt tausende von Spermien hinsichtlich der Beweglichkeit in unbeweglich, ortsbeweglich bzw. vorwärtsbeweglich zu differenzieren, die Linearität sowie Geschwindigkeit in unterschiedlichen Bewegungsformen zu erkennen, als auch die Amplitude des seitlichen Kopfausschlages der Spermienzelle zu registrieren (KATZ et al. 1985; WABERSKI et al. 1999). Somit ergeben sich neue Möglichkeiten für die Bewertung der Spermienmotilität unter besonderer Berücksichtigung der Qualität der Bewegung. JASKO (1992) fand jedoch auch bei der computerassistierten Motilitätsanalyse nur niedrige Korrelationen zur Fertilität eines Vatertieres Morphologie Man unterscheidet primäre, sekundäre und tertiäre morphologische Veränderungen. Primäre entstehen im Hoden während der Spermatogenese, zu ihnen zählen Kopf- und Kopfkappenschäden, Missbildungen des Mittelstücks, sowie para- und retroaxia-

39 39 le Schwanzansätze. Primäre Veränderungen zählen für die Fertilität des Vatertieres zu den schwerwiegendsten (BUSCH u. WABERSKI, 2007). Sekundäre Veränderungen treten während der Nebenhodenpassage auf. Beispiele hierfür sind abgelöste Kopfkappen, Plasmatropfen mit oder ohne Schwanzschleifen. Plasmatropfen können ein Indiz für zu hohen Deckeinsatz sein, bei normalem Deckeinsatz werden auch Störungen der Spermatogenese beschrieben (BUSCH u. WA- BERSKI, 2007). Tertiäre Veränderungen entstehen unabhängig vom Tier durch äußere Einflüsse, wie unsachgemäße Spermagewinnung und -verarbeitung. Sie stellen sich morphologisch ähnlich den sekundären Veränderungen dar (BUSCH et al., 1991). Für die Beurteilung von ungefärbten Spermien eignet sich eine Formaldehydlösung (HANCOCK, 1956) ebenso wie phosphatgepufferte NaCl-Formollösung oder Gluataraldehydlösung (STÄHR u. NEHRING, 1997). Mit Hilfe dieser Reagenzien werden die Spermien fixiert und somit die Untersuchung ermöglicht. Die Beurteilung der Spermien erfolgt mit einem Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung von Ölimmersion bei 800- bis facher Vergrößerung (BUSCH et al. 1991). Es werden mindestens 200 Spermien beurteilt (BUSCH et al. 1991; BUSCH u. WABERSKI, 2007; STÄHR u. NEHRING, 1997) Durchflusszytometrie Nachdem die Durchflusszytometrie erstmals 1965 in der Analyse von Blutzellen Anwendung fand, wurden 1974 die ersten Spermaproben untersucht (YAMADA et al., 1974).

40 Prinzip der Messung Auf das Funktionsprinzip der durchflusszytometrischen Untersuchung wurde bereits im Kapitel eingegangen. Im Unterschied zum Coulter Counter kommt im Flowzytometer eine optische Detektionseinheit zum Einsatz. Als Anregungsquelle werden fast ausschließlich Argon-Ionenlaser benutzt, deren Wellenlänge bei 488 nm liegt. Nach der Fluoreszenzfärbung und anschließender Anregung durch den Argon- Ionenlaser wird von der Zelle gestreutes und fluoreszierendes Licht emittiert (GRO- GAN u. COLLINS, 1990). Parallel können 3 Lichtparameter gemessen werden: 1. Forward Scatter (FSC) entspricht der Lichtbeugung, die proportional zum Zelldurchmesser ist dieser Parameter liefert Informationen zur Zellgröße. 2. Side Scatter (SSC) entspricht der Lichtbrechung und liefert Informationen über die Granulation des Zellinhaltes. 3. Fluoreszierendes Licht: die Wellenlänge hängt vom verwendeten Fluoreszenzfarbstoff der Färbung ab und ist proportional zur Anzahl der gebundenen Fluorochrommoleküle.

41 41 Abb. 10: Entstehung des Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtes bei der durchflusszytometrischen Messung von Spermien (modifiziert nach BECTON DI- CKINSON, 1999) Das von der Zelle emittierte Licht wird in Spannungsimpulse umgewandelt und anschließend digital weiterverarbeitet, sodass eine Übertragung an einen angeschlossenen Computer ermöglicht wird. Die verwendeten Farbstoffe bestimmen, welche Spermienfunktion durch die flowzytometrische Untersuchung betrachtet wird Lipidperoxidation Die Lipidperoxidation wird durch reaktive Sauerstoffradikale (ROS = reactive oxygen species) ausgelöst, die sich durch das Vorhandensein eines oder mehrerer ungebundener Elektronen charakterisieren. Zu ihnen zählen Superoxidanionen, Hydro-

42 42 genperoxide, Peroxylradikale sowie die äußerst reaktiven Hydroxylradikale (SIKKA, 2001). Diese Radikale reagieren unter Reduktion oder Oxidation des Reaktionspartners mit organischen Verbindungen um ihre eigene Elektronenstruktur zu stabilisieren. Abb. 11: Schema der zusammenhängenden Mechanismen zwischen oxidativem Stress, Antioxidantien und Fruchtbarkeitsaussicht (aus HECZKO, 2004) Die Hauptbestandteile einer Membran sind Cholesterin und Phospholipide; beide Membranbestandteile zählen zu den hauptsächlichen Substraten der ROS. Ausgelöst durch die oxidative Degeneration der Lipide durch die Sauerstoffradikale kommt es zu einem Motilitätsverlust der Spermienzelle und daneben zur Agglutination der Spermien miteinander (KIM u. PARTHASARATHY, 1998). Dies führt neben einer Störung der allgemeinen Funktionen eines Spermiums auch zu einer Verschlechterung der Fruchtbarkeit.

43 Bodipy/PI-Färbung Bodipy (DIPYrromethene BOron Difluoride) ist eine Fettsäure, die in der Lage ist, in die meisten Zellmembranen einzudringen, ohne jedoch dabei bestimmte Zellorganellen zu bevorzugen (DRUMMEN et al. 2002). Sie wird in Anwesenheit von ROS oxidiert, wobei es zu einem Farbumschlag des emittierten Lichtes von rot zu grün kommt. Die Oxidation von Bodipy kann jedoch nicht von allen reaktiven Sauerstoffspezies bewirkt werden. Hydroxyl- (OH ), Peroxyl-, Alkoxyl- und Peroxynitritradikale (ONOO-) sind dazu in der Lage, wohingegen Superoxid (O 2 -), Hydrogenperoxide (H 2 O 2 ) und Hydroperoxide (O 2 H) keinen oxidierenden Einfluss haben. Somit eignet sich Bodipy zur Detektion von ROS innerhalb von Membranen, wobei der Anstieg der grünen Fluoreszenz zur Beurteilung der Membranoxidation und somit der LPO herangezogen werden kann (HALLIWELL u. WHITEMAN, 2004) DCFH/PI-Färbung DCFH (Dichlorofluoreszin) ist per se nicht fluoreszierend, wird jedoch in Anwesenheit von ROS in das fluoreszierende Dichlorofluoreszein (DCF) umgewandelt, welches im grünen Bereich bei 525 nm fluoresziert (HALLIWELL u. WHITEMAN, 2004). DCFH und DCF sind membrangängig und können somit aus der Zelle in den Extrazellulärraum diffundieren (OHASHI et al. 2002). Auch die Oxidation von DCFH kann nicht von allen reaktiven Sauerstoffspezies bewirkt werden. Reaktiv zeigen sich Peroxyle, Alkoxyle, Carbonate, Hydroxyl- (OH ), Peroxynitrit- (ONOO-) und Nitrogendioxidradikalen (NO 2 ), wohingegen Hydrogenperoxide (H 2 O 2 ) und Superoxid (O 2 -) nicht dazu in der Lage sind (BILSKI et al. 2002; LEBEL et al. 1992).

44 44 Da jedoch zur Oxidation von DCFH zu DCF neben den ROS noch weitere Stoffe wie z.b. Peroxidasen nötig sind, stellt die Färbung mit DCFH keinen direkten Nachweis von ROS dar (HALLIWELL u. WHITEMAN, 2004). Untersuchungen von ROTHE et al. (1988) dagegen berichten von der Eignung DCFH s zum Nachweis von ROS DHR/PI-Färbung Auch DHR (Dihydrorhodamin) fluoresziert per se nicht, sondern wird durch ROS in Rhodamin 123 umgewandelt, das im grünen Bereich bei 536 nm fluoresziert. Es zeigt sich in Anwesenheit von Hydroxyl- (OH ), Peroxynitrit- (ONOO-) und Nitrogendioxidradikalen (NO 2 ) reaktionsfreudig und reagiert mit Superoxid- (O 2 -), Stickoxidradikalen (NO ) sowie mit Hydrogenperoxiden (H 2 O 2 ) nur schwach. Im Gegensatz zu DCFH ist DHR nicht in der Lage aus der Zelle zu diffundieren, sondern lagert sich in den Mitochondrien an. (HALLIWELL u. WHITEMAN, 2004).

45 45 3. Material und Methoden 3.1 Material Technische Einrichtung zur Versuchsdurchführung Die Versuchsdurchführung erfolgte in einem neu errichteten Sprungraum einer Schweinebesamungsstation, der sich an einen gleichfalls neu gebauten Stall für 120 Eber anschließt. Der Sprungraum war mit einem vertieften Bereich für das Stallpersonal ausgestattet. Eine solche Einrichtung war für das System Collectis erforderlich. Zu beiden Seiten dieser Grube waren je drei Sprungboxen angeordnet (Abb. 12). Die erforderliche Technik für das System Collectis sowie die Einrichtungen zur persönlichen Hygiene des Personals waren in dem vertieften Teil vorhanden. Abb. 12: Sprungraum Abb. 13: Materialien für Spermagewinnung mit Collectis Abb. 14: Das System Automate

46 46 Zu einer Einheit des Systems Collectis (zwei Geräte) gehörten folgende Komponenten: ein zentraler Schaltkasten, zwei Handbedienungselemente mit Steuerkasten zur Bedienung der künstlichen Vaginen (KV), sowie je eine Haltevorrichtung zur Fixierung der KV am Phantom. Um eine hygienisch einwandfreie Spermaqualität zu gewährleisten, wurden Einmalartikel verwendet: Liner, die die künstliche Vagina von innen auskleiden und einen direkten Kontakt mit der pneumatischen Gummimanschette der KV verhinderten. An die KV wurde der sog. Cône de Collection angeschlossen, ein Filter mit einem angeschweißten Plastikbeutel. Dieser Filter trennte das Bulbourethralsekret ab, die Spermaflüssigkeit floß in den Plastikbeutel. Die Absameinrichtung Automate der Firma Minitüb (Abb. 14) entsprach grundsätzlich dem gleichen Anliegen, bei mehreren Ebern gleichzeitig die Spermagewinnung durchzuführen. Es wurde allerdings bewusst auf die Verwendung von künstlichen Vaginen verzichtet. Zu dem System Automate gehörten folgende Komponenten: das Absamgerät, eine so genannte künstliche Cervix : sie bestand aus Moosgummi und besaß auf der Innenseite zur besseren Fixierung des Penis 3 Noppen, eine doppelte Schlauchfolie, das Spermagewinnungssystem aus Edelstahl, bestehend aus einer einstellbaren Klemmvorrichtung, um die künstliche Cervix samt Penis zu fixieren sowie einer Halterung und Schiene für das Spermaauffanggefäß. Sämtliche Komponenten wurden im Eberphantom installiert. Auch hier wurden aus Gründen der Hygiene Einmalartikel verwendet: so genannte Fixierringe, die am unteren Ende der Schlauchfolie angebracht als Kopplungsstücke zwischen Schlauchfolie und Spermaauffanggefäß fungierten sowie die künstlichen Cervices (AC) aus Moosgummi, welche benötigt wurden, um den Penis zu fixieren und ihn anschließend in die Klemmvorrichtung einzuspannen. Bei Automate war nicht zwingend eine Grube erforderlich, aber aus Gründen des einfacheren Handlings zu empfehlen.

47 Versuchstiere Die Untersuchungen fanden an insgesamt 17 Jungebern der Rasse Pietrain im Zeitraum September 2006 bis März 2007 an der Besamungsstation Neustadt / Aisch, Schauerheim statt. Alle Tiere waren in einer neuen Stalleinheit auf Sägemehl aufgestallt und wurden unter für eine Besamungseberstation üblichen Bedingungen gehalten. Die Eber zeigten ein ungestörtes Allgemeinbefinden und wiesen weder Anzeichen für eine Beeinträchtigung der Sexualfunktion noch eine Erkrankung der Geschlechtsorgane auf. Die Tiere befanden sich in einem Alter von 12 bis 15 Monaten. Es wurden bis zum Versuchsbeginn von jedem Tier bereits 3 bis 5 Ejakulate gewonnen. 3.2 Methoden Durchführung der Spermagewinnung, Gruppenbildung Rotation der Gewinnungsmethode Entsprechend der Aufgabenstellung der Arbeit wurden drei Spermagewinnungsmethoden im Vergleich angewendet: Handmethode Unter Verwendung eines Einmalhandschuhs wurde mit der Hand nach Umfassen der spiraligen Penisspitze Druck auf den erigierten Penis ausgeübt. Das ejakulierte Sperma wurde in einem Spermaauffangbeutel in einer gegen Temperatureinflüsse schützenden Hülle über 2 Lagen steriler Gaze aufgefangen. Die Isolierhülle diente gleichzeitig als Transportbehältnis in der Rohrpostanlage. Abweichend von der üblichen Verfahrensweise, bei der der Techniker neben dem Eber sitzt, wurde hier auch die Spermagewinnung stehend aus dem vertieften Teil des Absamraumes heraus durchgeführt.

48 48 Collectis der Firma Genes Diffusion Bei dieser Methode steht der Techniker vertieft in einer Grube, ähnlich einem Melkstand. Nachdem der Eber auf das Phantom gesprungen ist, wurde er manuell stimuliert und die Erektion herbeiführt. Zuvor wurde die im Präputium sowie im Präputialdivertikel befindliche Flüssigkeit ausmassiert. Anschließend wurde der Penis in die künstliche Vagina überführt, welche mit Hilfe einer innen liegenden, pneumatischen Manschette Druck auf den Penis ausübte. Der Techniker konnte danach den nächsten Eber vorbereiten, während die Ejakulation weitgehend selbständig erfolgte. Damit war die Möglichkeit gegeben, dass ein Techniker parallel von mehreren Ebern mit Hilfe einer solchen halbautomatischen Spermagewinnungseinrichtung Sperma gewinnen konnte. Nach Abschluss der Ejakulation erschlaffte der Penis und konnte von dem Eber selbst aus der KV gezogen werden. Automate der Firma Minitüb Bei dieser Methode wurde in der behandschuhten Hand mittels eines Klebestreifens die so genannte künstliche Cervix befestigt. Führte der Eber nach dem Aufsprung auf das Phantom Friktionsbewegungen aus, wurde zunächst die Flüssigkeit aus Abbildung : Eber während der Spermagewinnung, links mit Collectis, rechts mit Automate

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