Immunhistochemische Färbung F Immunfluoreszenz. Vortrag Immunologie am von Christopher Tollrian

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1 Immunhistochemische Färbung F und Immunfluoreszenz Vortrag Immunologie am von Christopher Tollrian

2 Inhalt Grundlagen Immunhistochemische Färbung Immunfluoreszenz Proben-Vorbereitung Methoden Anwendungsbereiche

3 Grundlagen: Immunhistochemie Prinzip: Sichtbarmachung und Lokalisation von Proteinen und damit spezifischer Strukturen in Zellen und Gewebsschnitten mit Hilfe von markierten Antikörpern. Diese sollten sich durch hohe Spezifität und Äffinität auszeichnen und keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen zeigen.

4 Immunhistochemische Färbung Grundreaktion: Antigen + Enzymkonjungierter Antikörper = = Enzymkonjungierter Antikörper-Antigenkomplex Farbreaktion: Enzym + Chromogen (farblos) = Enzym-Chromogenkomplex Enzym-Chromogenkomplex = Enzym + Endprodukt (farbig)

5 Immunhistochemische Färbung Typische Enzyme: Empfindlichkeit: Achtung: Peroxidase und alkalische Phosphatase sehr hoch, da Enzyme die bis fache Menge an Substrat pro Minute umsetzen können Enzym-Aktivität ist stark abhängig von der Konzentration des Enzyms und des Substrats, dem ph-wert, der Ionenkonzentration des Puffermilieus sowie von der Temperatur und dem Lichteinfall. Die Qualität der Färbung ist abhängig von diesen Bedingungen. Auswertung erfolgt an einem gewöhnlichen Lichtmikroskop

6 Immunfluoreszenz AK-Aufbau: Antikörper werden mit Fluorochromen konjugiert. Die Fluoreszenzfarbstoffe werden chemisch an die Antikörper gebunden, dies kann aber evtl. die AK-Struktur und damit die Immunreaktivität beeinflussen (vorherige Tests notwendig). Typische Fluorochrome: Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) Tetramethylrhodamin Isothiocyanat (TRITC) Auswertung erfolgt durch Fluoreszenzmikroskopie

7 Immunfluoreszenz Vorteile: Nachteile: - schnell und einfach Durchführung - Fluoreszenzfarbstoffe sind relativ instabil (Ausbleichen) - IF in vielen Fällen nur an Gefrierschnitten durchführbar - Färbungen häufig schlechter zu interpretieren und schwieriger bestimmten Gewebsstrukturen zuzuordnen (vor allem in der Diagnostik)

8 Proben-Vorbereitung Paraffin-Eingebettetes Gewebe: Gewebeproben werden in Formaldehyd getränkt um die Proteine miteinander zu vernetzen und lösliche Antigene zu immobilisieren Die Proteinvernetzung führt aber auch zur Maskierung oder Zerstörung antigener Strukturen Um maskierten Epitope wieder freizulegen, werden die Schnitte mit Enzymen oder mit Hitze vorbehandelt (nicht immer möglich) fixiertes Gewebe wird in Paraffin eingebettet und an einem Mikrotom in 2-5µm dünne Scheiben geschnitten

9 Proben-Vorbereitung Gefrierschnitte: Gewebeprobe muss schonend und schnell eingefroren werden um die Struktur gut zu erhalten Als Kältevermittler dient in flüssigen Stickstoff vorgekühltes Isopentat Gefrorene Gewebeprobe wird mit Gewebekleber und CO2 aufgeblockt und geschnitten Zellproben können mittels Zentrifugation auf Objektträger aufgebracht werden (z.b. Blut) oder man lässt die Zellen direkt auf Objektträger wachsen

10 Methoden: direkte Methode Bei der direkten Methode wird der spezifische Antikörper für das zu untersuchende Protein mit dem Enzym/Fluorochrom direkt gekoppelt. Enzym/Fluorochrom Antikörper Epitop

11 Methoden: indirekte Methode Der Epitop spezifische Antikörper, der an das zu untersuchende Protein bindet, ist in der indirekten Methode unmarkiert, also nicht mit einem Enzym/Fluorochrom versehen. Sekundärantikörper Enzym/Fluorochrom Die Färbung erfolgt in einem zweiten Schritt, bei dem ein zweiter markierter Antikörper auf die Probe aufgebracht wird der spezifisch an den ersten Antikörper bindet. Diese Methode ist um ein vielfaches empfindlicher als die direkte Methode, da mehrere Sekundärantikörper (und somit mehrere Enzyme/Fluorochrome) an einen Primärantikörper binden können (Signalverstärkung) Epitop Primärantikörper

12 Methoden: Beispiele für enzymgekoppelte Färbung PAP-Methode APAAP-Methode Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP) Alk. Phosphatase-Anti-Alk. Phosphatase (APAAP)

13 Anwendungsbereiche Diagnostik: - Klassifizierung und Diagnose von wenig differenzierten malignen Tumoren - Identifikation der Lokalisation des Primärtumors beim Vorliegen einer Metastase - Klassierung von Lymphomen und Leukämien - Bestimmung von prognostischen und prädiktiven Faktoren - Identifikation von infektiösen Erregern - Selektive Darstellung bestimmter Zelltypen zur Beurteilung derer Frequenzen und Verteilung im Gewebe - Durchfusszytometrie /FACS Forschung: - Nachweis, Identifizierung und Lokalisation von Proteinen in Zellen oder Geweben im Bereich der Biologie, Medizin usw.

14 Noch Fragen? Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit!