Enzyme: Grundlegende Konzepte und Kinetik

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1 Enzyme: Grundlegende Konzepte und Kinetik Enzyme sind Katalysatoren biologischer Systeme Wichtigste Eigenschaften: katalytische Stärke und Spezifität Nahezu alle bekannten Enzyme sind Proteine, es gibt aber auch RNA-Moleküle die katalytische Aktivität haben Im Prinzip katalysieren Enzyme Reaktionen durch Stabilisierung des jeweiligen Übergangszustands, dem energiereichsten Spezies im Reaktionsmechanismus 1

2 Enzyme sind leistungsstarke und (hoch)spezifische Katalysatoren 2

3 Carboanhydrasereaktion Selbst eine so einfache Reaktion wie die Hydratisierung von CO 2 wird durch ein Enzym katalysiert. Tatsächlich ist die Carboanhydrase eines der schnellsten aller bekannten Enzyme; jedes Enzymmolekül kann pro Sekunde 10 6 Moleküle CO 2 hydratisieren; d.h. die katalysierte Reaktion ist ca mal schneller als die unkatalysierte 3

4 Beispiel: proteolytische Enzyme Subtilisin (aus Bakterien) unterscheidet fast gar nicht zwischen den Seitenketten (R 1, R 2 ) 4

5 Beispiel: proteolytische Enzyme Trypsin (Verdauungsenzym) spaltet nur Peptidbindungen auf der Carboxylseite von Lysin- oder Argininresten Thrombin (Blutgerinnung) katalysiert nur die Hydrolyse von Arg-Gly- Bindungen in ganz spezifischen Peptidsequenzen 5

6 Viele Enzyme benötigen Cofaktoren Apoenzym + Cofaktor Holoenzym Zwei Gruppen: kleine organische Moleküle und Metalle Cofaktoren, die kleine organische Moleküle sind, werden als Coenzyme bezeichnet. Sie leiten sich oft von Vitaminen ab und können entweder fest oder lose an das Enzym gebunden sein Sind sie fest gebunden, nennt man sie prosthetische Gruppe Lose gebundene Cofaktoren verhalten sich eher wie Cosubstrate, da sie sich genauso wie Substrate und Produkte an das Enzym binden und freigesetzt werden 6

7 Wozu Cofaktoren? Enzyme sind meist Proteine Proteine enthalten: Saure Gruppen (COOH) Basische Gruppen (NH 2 ) Hydroxylgruppen (OH) Redoxvorgänge können von Proteinen praktisch nicht katalysiert werden. 7

8 Wozu Cofaktoren? Redoxvorgänge Redoxcofaktoren Fixieren von Hxdroxyl- und Carboxylgruppen Metallkationen 8

9 Cofaktoren R R R R R (R) R R 9

10 Vitamine und Cofaktoren 10

11 Strukturen einiger wasserlöslicher Vitamine 11

12 Klassifizierung von Enzymen Viele Enzyme haben allgemeine Namen, die keine Information über die Reaktion liefern, die sie katalysieren (z.b. Trypsin) Die meisten Enzyme werden nach den Substraten und Reaktionen genannt, die sie katalysieren 1964 wurde die Enzyme Commission gegründet, um eine einheitliche Nomenklatur zu entwickeln Sie unterteilten die Reaktionen in 6 Hauptklassen, die von 1 bis 6 durchnummeriert sind. Diese Gruppen untergliederten sie immer weiter, so dass eine vierstellige Zahl, der die Buchstaben EC vorangestellt sind, alle Enzyme genau identifiziert 12

13 Klassifizierung von Enzymen Siehe auch: 13

14 Thermodynamik der Katalyse Die Gibbs-Energie (G) (ab und zu noch freie Enthalpie genannt) ist eine wichtige thermodynamische Funktion zum Verständnis von Enzymreaktionen. Zu beachten: K K K r J J J J J f J G ( T) G ( T) G ( T) J=A J=A J=A Voraussetzung: K JA B 0 J J 14

15 Kinetik der Katalyse Die Aktivierungs-Gibbsenergie r G (oft als G bezeichnet) ist meist nicht direkt zugänglich. Messbar sind die Arrhenius-Aktivierungsenergien (E a ) via Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante. 15

16 Thermodynamik der Katalyse REP r G liefert Informationen über die Spontaneität einer Reaktion. Eine Reaktion ist spontan, falls r G < 0 (exergonisch). Ein System ist im Gleichgewicht, wenn r G = 0. Eine Reaktion mit r G > 0 nennt man endergonisch. Damit eine solche Reaktion vollständig abläuft, muss Energie zugeführt werden. 16

17 Thermodynamik der Katalyse REP Die G-Funktion ist eine Zustandsfunktion. Der numerische Wert von r G hängt nicht vom Reaktionsweg ab (d.h. ist vom molekularen Reaktionsmechanismus unabhängig!). r G sagt nichts über die Geschwindigkeit einer Reaktion aus! Die Reaktionsgeschwindigkeit ist von r G (bzw. E a ) abhängig. Es gibt keine Korrelationen zwischen r G und r G (ausser in gewissen Modellen!). 17

18 Thermodynamik der Katalyse REP aa bb cc nn oo pp ln r r G G RT Q Q n o p a a a N O P a b c a a a A B C 18

19 Thermodynamik der Katalyse Bei gelösten Stoffen: Q a n o p a a a N O P a b c a a a A B C c J J J J c c J Q n o p n o p c c c c c c A B C n o p c c c N O P a b c c c c A B C N O P N O P a b c a b c A B C (alle J = 1) 19

20 Thermodynamik der Katalyse ' Konvention: G : G (ph 7) r r d.h. c 7 10 M H alle übrigen c sind 1 M 20

21 Beispiel 2 H e = H 2 E o := 0 V E o :=? V R T V E E ln Q E log Q z F z Q a H H a a c 1 H e H p R T z F V V 2 ' E E ln10logq 21

22 Thermodynamik der Katalyse ' rg RT ln K ' RT log K ' (ph = 7) K r G RT ' e 10 ' rg ' RTln10 Bei Raumtemperatur ( K) gilt: K ' 10 rg kjmol 5.71 kj mol '

23 Thermodynamik der Katalyse Eine Änderung von K um einen Faktor 10 entspricht einer Änderung von r G um 5.71 kj mol -1 23

24 Enzyme können nur die Reaktionsgeschwindigkeit, aber nicht das Reaktionsgleichgewicht verschieben Ein Enzym kann die Gesetze der Thermodynamik nicht verändern und folglich auch nicht das Gleichgewicht einer Reaktion verschieben. Das heisst, ein Enzym beschleunigt die Hin- und die Rückreaktion um genau denselben Faktor. Enzyme beschleunigen die Einstellung des Gleichgewichts, verschieben es jedoch nicht nach irgendeiner Seite. 24

25 Übergangszustand Eine chemische Umwandlung des Substrats S in das Produkt P verläuft über den Übergangszustand S, der eine höhere Gibbs-Energie besitzt als das Substrat. G 25

26 Übergangszustand Es besteht ein Gleichgewicht zwischen Grundzustand und Übergangszustand. Alle Übergangszustände zerfallen bei gleicher Temperatur gleich schnell. K S S P k x K c c S S 26

27 Übergangszustand x S S P k K r S S G RT c K e c r P d d G RT x S c v k c e t B x k T k h Bei 25 C: k x = s -1 27

28 Übergangszustand Annahmen: c S r G kJmol 1M, T 298K c S 5 10 c S v = Ms -1 K c c S S e G r RT 28

29 Übergangszustand Enzyme beschleunigen Reaktionen durch Erniedrigung von r G, der Aktivierungs-Gibbsenergie. Die Verbindung von Substrat und Enzym schafft einen neuen Reaktionsweg, dessen Übergangszustand eine niedrigere Energie aufweist als der ohne Enzym ablaufenden Reaktion Die Erniedrigung der Aktivierungsenergie hat zur Folge, dass mehr Moleküle die erforderliche Energie besitzen, um den Übergangszustand zu erreichen Das Wesen der Katalyse besteht in der spezifischen Bindung und Stabilisierung des Übergangszustands 29

30 Enzym Substratkomplexe Die Substrate werden in günstiger räumlicher Ausrichtung zu Enzym-Substrat- Komplexen zusammengeführt. Dabei werden die Substrate an eine spezifische Region des Enzyms gebunden, die man als aktives Zentrum bezeichnet Indirekter Beweis durch Sättigungskinetik: Bei genügend hohen Substratkonzentrationen sind alle katalytischen Zentren besetzt 30

31 Struktur eines Enzym-Substrat- Komplexes Cytochrom-P 450 -Oxidase ist mit seinem gebundenen Substrat Campher dargestellt 31

32 Aktive Zentren haben gemeinsame Eigenschaften 1. Das aktive Zentrum ist eine dreidimensionale Spalte, die von vielen Gruppen aus verschiedenen Abschnitten der Aminosäuresequenz gebildet wird 2. Das aktive Zentrum stellt nur einen relativ kleinen Teil des Gesamtenzyms dar 3. Aktive Zentren sind höhlen- oder spaltenförmig 4. Substrate werden durch viele schwache Kräfte an das Enzym gebunden 5. Die Bindungsaffinität ist von der definierten Anordnung der Atome im aktiven Zentrum abhängig 32

33 Aktive Zentren können weit voneinander entfernte Reste enthalten 33

34 Wasserstoffbrücken zwischen einem Enzym und einem Substrat 34

35 Schloss-Schlüssel-Modell der Enzym-Substrat-Bindung 35

36 Modell des induced fit der Enzym- Substrat-Bindung 36

37 Übergangszustand 37

38 Michaelis-Menten-Kinetik 38

39 Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit 39

40 Steady state Bedingungen k k 1 2 E S ES E P k 1 dc dt ES Annahme: 0 c ES konstant 40

41 Steady state Bedingungen 41

42 V 0 k 2 Michaelis-Menten-Gleichung k 1 k 2 E S ES E P K M k 1 k 2 k 1 E T S S K M Die Maximalgeschwindigkeit V max wird erreicht, wenn alle Bindungsstellen am Enzym mit Substrat gesättigt sind wenn also [ES] = [E] T ist V max k 2 E T k 1 V 0 V max S S K M 42

43 K M -Werte 43

44 Übung Enzyme A) In zwei verschiedenen Zellextrakten, Extrakt A und Extrakt B, wird die Aktivität des Enzyms Aldolase mit gleichen Enzymassays gemessen. Die Aktivität der Aldolase (ausgedrückt als Mol umgesetztes Substrat pro Gramm Extrakt) ist unter verschiedenen Bedingungen im Extrakt A immer 5 mal höher als im Extrakt B. Was ist die einfachste Erklärung für diese Beobachtung? B) Sie messen nun in einem der Extrakte die Aktivität der Aldolase in Abhängigkeite der Substratkonzentration. Bei einer Substratkonzentration von 0.04 mm messen Sie eine Aktivität, die 80% von V max entspricht. Wie gross ist K M für diese Aldolase? 44

45 K M -Werte V V 0 max K M S S 0.8 V V max max K M KM 0.01mM 45

46 Wechselzahl, turnover number Aus V max ergibt sich die Wechselzahl eines Enzyms, d.h. die Anzahl Substratmoleküle, die bei vollständige Sättigung des Enzyms mit Substrat pro Zeiteinheit in das Produkt umgewandelt werden Die Wechselzahl entspricht der kinetischen Konstante k 2, die auch als k kat bezeichnet wird V max k 2 E T k 2 V max E T 46

47 Das kinetische Optimum der enzymatischen Katalyse: das k kat /K M -Kriterium Unter physiologischen Bedingungen liegt das Verhältnis [S]/K M meistens zwischen 0.01 und 1, d.h die enzymatische Geschwindigkeit liegt weit unter k kat, weil die meisten aktiven Zentren bei [S] << K M unbesetzt sind Geeigneter Parameter zur Charakterisierung der Enzymkinetik unter diesen Bedingungen: V 0 k kat K M S E (folgt aus steady state Annahme) V 0 k kat K M S E T Für [S] << K M 47

48 d k 1 k 2 E S ES E P ES dt k 1 Steady state: d E S ( ) ES k k k ES dt d ES dt 0 k E S ( k k ) ES k 1 k k K 1 ES ES ES 1 2 M d P dt k V0 k2 K ES 2 E S M 48

49 Substratpräferenzen von Chymotrypsin 49

50 Wie effizient kann ein Enzym sein? Gibt es physikalische Grenzen für den Wert von k kat /K M? k kat K M k kat k 1 k kat k 1 k kat k 1 k kat k 1 k 1 Der Wert von k kat /K M wird letztlich von k 1 begrenzt, der Bildungsgeschwindigkeit des Enzym-Substrat-Komplexes. Diese Geschwindigkeit kann nicht grösser werden als die Geschwindigkeit der diffusionsbedingten Begegnung von Enzym und Substrat Die Diffusion beschränkt den Wert so dass er 10 8 bis 10 9 s -1 M -1 nicht übersteigen kann 50

51 Kinetische Perfektion Die Katalysegeschwindigkeit von kinetisch perfekten Enzymen wird nur durch die Geschwindigkeit begrenzt, mit der sie in Lösung ihrem Substrat 51 begegnen.

52 V 0 k 2 Michaelis-Menten-Gleichung k 1 k 2 E S ES E P K M k 1 k 2 k 1 E T S S K M k 1 REP Die Maximalgeschwindigkeit V max wird erreicht, wenn alle Bindungsstellen am Enzym mit Substrat gesättigt sind wenn also [ES] = [E] T ist V max k 2 E T V 0 V max S S K M 52

53 Lineweaver-Burk-Diagramm 1 K 1 1 M V V V S 0 max max 53

54 Reversible Enzym-Hemmung 54

55 Kompetitive Hemmung Ein kompetitiver Inhibitor vermindert die Katalysegeschwindigkeit, indem er den Anteil der Enzymmoleküle mit gebundenem Substrat verringert. Das Kennzeichen der kompetitiven Hemmung besteht darin, dass sie durch eine ausreichend hohe Substratkonzentration überwunden werden kann. In Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors ist V max unverändert, dafür K app M K M (1 I ) K i 55

56 Kompetitive Hemmung I V V V K 1 1 K 1 M 1 S 0 max max i 1/ K M 1/V max 56

57 Nichtkompetitive Hemmung Bei nichtkompetitiver Hemmung kann das Substrat immer noch an den Enzym-Inhibitor-Komplex binden, aus dem Enzym- Substrat-Inhibitor-Komplex kann aber kein Produkt gebildet werden. V max nimmt ab, K M bleibt unverändert, weil sich das verbleibende Enzym wie eine verdünnte Lösung verhält. Lässt sich nicht durch eine Erhöhung der Substratkonzentration ausschalten 57

58 Nichtkompetitive Hemmung V app max V 1 max I K i 58

59 Nichtkompetitive Hemmung K 1 M V I 0 Vmax S 1 Ki 1/ K M 1/V max 59

60 Analoga des Übergangszustandes sind starke Enzyminhibitoren Isomerisierung von L- zu D-Prolin verläuft über einen planaren Übergangszustand 60