Module Genitale - Künstliche Besamung

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1 Module Genitale - Künstliche Besamung Spermabeurteilung Johannes Kauffold & James Erices

2 Spermatologische Untersuchung Methodisches Vorgehen Spermatologische Nomenklatur Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden

3 Ziel der spermatologischen Untersuchung Die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen ermitteln Natives Sperma Verdünntes Sperma Besamungsportion Die präsumptive Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen erfassen

4 Bei jeder Spermauntersuchung zu beachten: Sie ist lediglich eine Information über die zu erwartende Fertilität der Spermien. Es wird nur ein Teil des Ejakulates (oder der Besamungsportion) untersucht und bewertet. Die Untersuchung eines einzigen Ejakulates dient zur Orientierung, ist aber nicht ausreichend für eine diagnostische Aussage. Erneute Untersuchung (n), wenn notwendig, je nach Tierart nach 3 5 Tagen.

5 Samenuntersuchungen: bei Besamungstieren: Mindestanforderungen und/oder Grenzwerte bei Decktieren: o.g. Mindestanforderungen gelten nur als Bezugsgröße bei Vatertieren für die Arterhaltung: Beurteilung anhand der Grenzwerte

6 Spermatologische Untersuchungsverfahren Die biologische Samenuntersuchung umfasst: makroskopisch mikroskopisch chemisch - Volumen Farbe Konsistenz Geruch Beimischungen Konzentration Beweglichkeit Massenbewegung Vorwärtsbewegung Anteil lebender Spermien Resistenztests Agglutination Abnorme Spermien Fremdzellen und andere Beimengungen physikalisch ph-wert - Osmolarität

7 Makroskopische Untersuchung Volumen (Menge, ml) tierartspezifisch abhängig von Alter, Rasse, Jahreszeit, Absamtechnik Bei Eber und Hengst wird das Ejakulat zunächst filtriert und dann das Volumen ermittelt.

8 Aussehen Makroskopische Untersuchung Farbe elfenbeinfarben (Schaf, Ziege, Rind) weißlich (Rind, Pferd, Schwein) weißlich-gelb (Rind gelblich (Rind) weißlich-grau (Pferd) veränderte Farben rötlich (Hinweis auf frisches Blut) bräunlich (Hinweis auf altes Blut o. Schmutz) grau o. grünlich (Hinweis auf Eiterbeimengungen

9 Aussehen Konsistenz wird nur geschätzt, dient lediglich zur Groborientierung lässt erste Rückschlüsse auf Spermiendichte zu je spermienreicher das Ejakulat ist, desto konsistenter ist es! rahmig (Geflügel, Schaf, Ziege, Rind milchig (Rind, Pferd, Schwein, Hund) molkig (Pferd, Schwein, Hund) wässrig: abnorm, Hinweis auf Oligozoospermie oder Azoospermie

10 Eber: Ejakulatmenge Bulle: Ejakulatmenge

11 Makroskopische Untersuchung Geruch Beimengungen - natives Sperma nahezu geruchlos - Harngeruch, fauliger Geruch, stark tierspezifischer Geruch: zu beanstanden - Kotpartikel, Haare u.a. im Ejakulat: Ausdruck mangelhafter Hygiene beim Absamen Ejakulate verwerfen

12 Mikroskopische Untersuchung(1) Spermienkonzentration grobsinnlich

13 Mikroskopische Untersuchung(1) Spermienkonzentration Def. Anzahl der Spermien pro Volumeneinheit Millionen Spermien pro µl, mm 3, ml Methoden: Auszählen der Spermien in einer Zählkammer (Hämozytometer) sehr gute und zuverlässige Methode, vor allem für Unterscheidung zwischen Spermien und ejakulatfremden Zellen für die Routine arbeits- und zeitaufwendig!

14 Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte Zählkammer nach Bürker-Türk Zählkammer nach Thoma neu

15 Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte 1,01 0,5 Aufziehen von Sperma in die Blutzellpipette bis zur Marke 0,5; anschließend aqua dest. bis zur Marke 1,01 (Verdünnung 1:200) Durchmischen des Spermas mit aqua dest. durch Schütteln der Pipette

16 Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte Vorbereitung der Zählkammer: Deckgläschen auf Zählkammer auflegen und fest andrücken bis Newton sche Farbringe sichtbar werden Einige Tropfen verwerfen, Pipettenspitze abtupfen und nächsten Tropfen auf vorbereitete Zählkammer auftragen Einen Tropfen des Sperma-aqua dest.-gemisches wird auf die Zählkammer direkt vor dem Deckglas aufgebracht und gelangt dann durch Kapillarkräfte gleichmäßig in die Vertiefung der Zählkammer mit den Quadraten

17 Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte - Auszählung bei 40-facher Vergrößerung - es werden nur Spermien gezählt, deren Köpfe innerhalb eines Quadrates oder auf der Begrenzungslinie unten und links liegen - gezählt werden 5 große Quadrate, ein großes Quadrat besteht aus je 16 kleinen Quadraten - die 5 großen Quadrate dürfen nicht direkt benachbart sein

18 Mikroskopische Ejakulatuntersuchung - Dichte D = Gesamtzahl ausgezählter Spermien (A) Fläche x Kammerhöhe x Verdünnungsgrad in µl = A x in Mio./ml = A x 10

19 Mikroskopische Untersuchung(1) Spermienkonzentration Methode: Auszählen der Spermien mit Weitere Methoden: fotoelektrischen Geräten: - Fotometer (Kolorimeter) - Coulter counter elektronischer Teilchenzählgerät - Durchflusszytometer Messung von fluoreszenzfarbstoff- markierten Spermien

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21 Mikroskopische Untersuchung (2) Spermienmotilität subjektive Methoden: Massenbewegung Einzelbewegung Massenbewegung - fischzugartige, wellen- oder schwarmförmige Bewegung der Gesamtheit der Samenzellen - sie wird durch Konzentration und Vitalität der einzelnen Samenzellen verursacht - Untersuchung: Ein linsengroßer Spermatropfen auf einem Objektträger ohne Deckglas bei facher Vergrößerung

22 Beurteilung der Massenbewegung der Spermien bei Wiederkäuern Bewegung Bewertung keine Wellenbewegungen 0 langsame Wellenbewegungen + lebhafte Wellenbewegungen ++ intensive Wellen- und Wirbelbildung +++

23 Mikroskopische Untersuchung(2) Spermienmotilität Einzelbewegung, in % differenziert nach: - vorwärtsbeweglichen Spermien (V) - ortsbeweglichen Spermien (O) - unbeweglichen Spermien (U) Untersuchung: Ein senfkorngroßer Tropfen auf einem Objekträger mit Deckglas ( fache Vergrößerung)

24 Vorwärtsbewegung der Samenzellen Anforderung: Ein gutes Sperma soll unmittelbar nach der Gewinnung vorwärtsbewegliche Spermien aufweisen wie folgt: Wiederkäuer 70% Eber 50% Hengst 50% Rüde 75%

25 Bildauswertesystem für Motilitätsmessungen an Spermatozoen

26 Spermatozoenspuren farbig dargestellt

27 Bildschirmausdruck der Messergebnisse

28 Mikroskopische Untersuchung (2) Anteil lebender Spermien (Vitalität) - Feststellung mit Hilfe von Färbeverfahren - Eosin-Nigrosin-Färbung: lebende Spermien ungefärbt tote Spermien gefärbt (geschädigte Plasmamembran) Lebend-Tot-Rate (L T R) Anforderung: 75-25% - Triple-Stain-Färbung (+ Akrosom; Trypanblau + Bismarck- Braun + Rosa-Bengal)

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30 Färbung von Spermatozoen mit der Triple-stain-Technik zur Beurteilung der Vitalität und des Akrosomenstatus. A: lebendes Spermium mit intaktem Akrosom; B: lebendes Spermium ohne Akrosom; C: totes Spermium mit intaktem Akrosom; D: totes Spermium ohne Akrosom. (Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)

31 Mikroskopische Untersuchung (3) Resistenztests - Überprüfung der Lebensdauer des verdünnten Spermas bei Belastung (Routinediagnostik) Verringerung der Spermienmotilität Haltetest: 72 h Lagerung bei bestimmter T Thermoresistenztest: mehrere Std. bei 38 C HOS-Test (hypoosmotischer Schwelltest zur Testung der Membranintegrität) Tiefgefrierung

32 Mikroskopische Untersuchung (3) HOS Mögliche morphologische Veränderungen, die durch den Einfluss der HOS-Lösung auftreten können. Die schraffierten Bereiche zeigen Schwellungen am Spermatozoenschwanz an. Das links dargestellte Spermium zeigt keine Schwellung, es ist somit vom Verlust der Membranintegrität auszugehen. (Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007)

33 Mikroskopische Untersuchung (3) Agglutination Im normalen Ejakulat keine Zusammenklumpung der Samenzellen Fremdzellen und andere Beimengungen - Epithel-, Blutzellen, Vorstufen der Spermien (Rundzellen),Schmutzpartikel - Sperma ist nie keimfrei

34 Agglutination bei Ebersperma (Farelli-Färbung)

35 Bacteria-Sperm Interaction (Diemer et al., 1996) E. coli! (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

36 Morphologie Mikroskopische Untersuchung (3) Abnorme Spermien - im normalen Ejakulaten treten morphologisch abweichende Spermienformen auf - keine verminderte Befruchtungsfähigkeit der Spermien, wenn sie 20% nicht überschreitet! Ätiologische Klassifikation der abnormen Samenzellen primäre Veränderungen sekundäre Veränderungen tertiäre Veränderungen - Methode: Färbung nach Papanicolaou

37 Schema für die Klassifizierung missgebildeter Spermien (nach Leidl et al. 1971)

38 Schema für die Klassifizierung missgebildeter Spermien (nach Leidl et al. 1971)

39 Schematische Darstellung der verschiedenen Spermiendefekte

40 Schematische Darstellung der verschiedenen Spermiendefekte

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42 Chemisch-physikalische Untersuchung ph-wert Messung, um metabolische Aktivität der Spermien zu erfassen Indikatorpapier (in der Routineuntersuchung ph-meter (für exakte Messung) Osmolarität bei normalen Ejakulaten liegt der Wert zwischen mosmol (isotonischer Bereich)

43 ph-wert des Spermas bei verschiedenen Haustieren Tierart Schwankungsbereich Bulle 6,2-6,8 Bock 6,2-6,9 Eber 6,8-7,8 Hengst 6,8-7,4 Rüde 6,7-6,8

44 Spezielle Spermatologie Indikationen: Subfertilität bei klinisch unauffälligen Befunden und Normospermie Qualitätskontrolle von konserviertem Sperma Ermittlung der Konservierfähigkeit von Sperma einzelner Vatertiere Wissenschaftliche Forschung vor allem über Spermienphysiologie und Spermakonservierung Einige Verfahren: CASA, Durchflusszytometrie, Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA), Membranintegrität, In-Vitro- Kapazitationstests u. a.

45 Spezielle Spermatologie Abbildung 1: Spermiensubpopulation Fluoreszenzoptische und durchflusszytometrische Darstellung von 4 Spermiensubpopulationen: Integrität von Spermienplasma- (PM) und Akrosommembran (AM) nach Doppelfärbung mit Propidiumjodid (PI) und FITC- PNA. Q1: PI-positive und FITC-PNA-negative Zellen: PM defekt, AM intakt; Q2: PI-positive und FITC-PNA-positive Zellen: PM und AM defekt; Q3: PInegative und FITC-PNA-negative Zellen: PM und AM intakt; Q4: PI-negative und FITC- PNA-positive Zellen: PM intakt, AM defekt.

46 Spezielle Spermatologie Abbildung 3: Eberspermien Ovidukt Explant Assay : an ein Eileiterexplant gebundene Eberspermien. Vergrößerung 250.

47 CASA Computer Assistant Semen Analysis Quelle: Internet Quelle: s2.0-s x gr2.jpg

48 Spermatologische Nomenklatur Normospermie Alle Spermabefunde erfüllen Mindestforderungen. Dysspermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen gering bis mittelgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf. Pathospermie Ein oder mehrere Spermabefunde weisen hochgradige Abweichungen von den Mindestanforderungen auf.

49 Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (1) Normospermie entspricht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit der Potentia generandi Dysspermie entspricht einer herabgesetzten Potentia generandi Pathospermie entspricht völliger oder partieller Impotentia generandi

50 Diagnostische Aussagen von spermatologischen Befunden (2) Die Qualität des Ejakulates kann Auskunft über die Funktionsfähigkeit des Genitaltraktes geben Die Aussagen der Spermabefunde sollten immer im Zusammenhang mit den klinischen Befunden erfolgen Normospermie Potentia generandi zuchttauglich Dysspermie herabgesetzte Potentia generandi bedingt zuchttauglich Pathospermie völlige o. partielle Impotentia generandi zuchtuntauglich

51 Take Home Fragen 1. Worauf ist bei der spermatologischen Untersuchung zu achten? 2. Wie kann die Spermienkonzentration erfasst werden? 3. Welche Färbungen sind zur Beurteilung von Spermien gebräuchlich? 4. Was ist der HOS-Test? 5. Was verstehen Sie unter CASA?

52 Module Genitale - Künstliche Besamung Spermaaufbereitung & -konservierung Johannes Kauffold & James Erices

53 Samenaufbereitung für den Einsatz in der instrumentellen Samenübertragung Verwendung als: unverdünntes Frischsperma flüssigkonserviertes Sperma gefrierkonserviertes Sperma Konservierungsdauer: wenige Stunden einige Tage unbegrenzte Zeit

54 Spermaverarbeitung (oder Spermaaufbereitung) Spermaverdünnung Wirkung der Verdünnung auf die Spermien: lebensverlängernd Spermakonservierung Aufgabe der Konservierung: Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien

55 Anforderungen an die Verdünnungsmittel Vergrößerung des Ejakulatvolumens Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva Ausreichende Pufferkapazität und geeigneter ph-wert Erhaltung des osmotischen Gleichgewichtes

56 1. Vergrößerung des Ejakulatvolumens Zweck: maximale Nutzung des genetischen Potentials eines Vatertieres Beispiele: Zu beachten ist: Bulle: von einem einzigen Ejakulat können 150 Besamungsportionen hergestellt werden (TG-Sperma) Eber: 1000 Spermaportionen pro Jahr (Flüssigsperma) Besamungserfolg sinkt ab, wenn die Zahl der Spermien pro Dosis einen bestimmten Schwellenwert unterschreitet!

57 2. Zugabe von Nähr- und Schutzstoffen und Kryoprotektiva Verdünnermedien enthalten u.a. folgende Grundsubstanzen: als Energiespender: - Glukose, Fruktose, Laktose, Natriumcitrat, Milch, Trockenmagermilch als Kryoprotektiva - Glycerol, Eidotter als keimhemmende Substanzen: - Antibiotika (EU: Penicillin, Streptomycin, Lincomycin, Spectomycin)

58 Warum Eidotter als Komponente von Verdünnermedien? Vorteile des (frischen, keimfreien) Hühnereigelbs: Schutz vor Kälteschock ( Bildung einer Lezithinhülle rings um die Spermien Anabiose) es enthält Glukose, Aminosäuren, Vitamine, Enzyme Nachteile: sehr guter Bakteriennährboden nicht sterilisierbar

59 Antibiotika? Vor allem für flüssigkonserviertes Sperma essentiell!

60 Verhalten von Bakterien in Bakterien sind ziemlich abgehärtet und gut adaptiert an die Umgebung Bakterien betrachten Verdünner als ideale Kulturmedien Lösungen in vitro Adapted from Banwart, 1979 (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

61 Flüssigkonserviertes Sperma Bakterielle Belastung abhängig von die initialen Menge, zusätzlichem Eintrag & Lagerungszeit Time storage Number bacteria (cfu/ml) 0 h Mio 48 h 0 3 Mio 96 h Mio Chansilpa (1987), Penicillin-Streptomycin (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

62 Flüssigkonserviertes Sperma Trend zu längerer Haltbarkeit und Lebensdauer Bacterial Contaminant Growth in Extended Boar Semen (16C) 2000 Extended-chilled semen (porcine) Amount of Bacteria (Log growth) 1E+16 1E Extender A Extender B Extender C year Days Stored storage time (days) Bakterien können proliferieren! (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

63 Example Generation Intervals Achromobacter xylosoxidans Serratia marcescens Inoculated 10 5 total CFU in broth Monitor transmittance (630 nm) till plateau (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

64 Achromobacter xylosoxidans 5.E+08 5.E+08 4.E+08 4.E+08 Bacterial number 3.E+08 3.E+08 2.E+08 2.E+08 1.E+08 5.E+07 0.E C 22 C 16 C -5.E Hours (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

65 Serratia marcescens 8.E+08 7.E+08 6.E+08 Bacterial number 5.E+08 4.E+08 3.E+08 2.E C 22 C 16 C 1.E+08 0.E Hours (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

66 Isolate Temp. Generation time Negative Effects (12X) Achromobacter xylosoxidans Serratia marcescens 16 C hr 7.5 d 22 C 12.1 hr 6.05 d 37 C 8.21 hr 4.1 d 16 C 4.26 hr 2.13 d 22 C 2.20 hr 1.1 d 37 C 1.01 hr 0.5 d (Quelle: Prof. GC Althouse, PA, USA)

67 Anforderungen an ein AB Ausreichend in Menge Muss in die Bakterien eindringen können & Abtöten/Deaktivieren Hängt ab vom: Bakterium & AB & Extender Drawbacks: Unwirksamkeit/Resistenzen

68 3. Pufferkapazität und ph-wert des Verdünners optimale Pufferkapazität: Verhinderung von Spermienschädigungen infolge der aeroben und anaeroben toxischen Stoffwechselprodukte (Citronensäure, TRIS, EDTA, TES, HEPES) geeigneter ph-wert: Verhinderung der herabgesetzten Motilität der Spermien infolge ph-wert-senkung

69 ph-wert des Spermas und des Verdünners Tierart Sperma Verdünner Bulle 6,2-6,8 6,0-6,5 Bock 6,2-6,9 6,5-7,0 Eber 6,8-7,8 7,0-7,5 Hengst 7,0-7,5 ca. 7 Rüde 6,7-6,8 6,5-6,9

70 4. Osmolarität der Verdünnermedien Osmolarität normaler Ejakulate: mosmol Abweichungen von den osmotischen Normalverhältnissen: > Änderungen der Membranpermeabilität < Herabsetzung der Spermienvitalität, < 200 mosmol/l: Herabsetzung der Spermienmotilität

71 Samenkonservierung Haltbarmachung des Samens für einen begrenzten oder unbegrenzten Zeitraum Samenübertragung

72 Auswirkungen des Kühlschocks auf die Samenzellen Frisch ejakuliertes Sperma verliert seine Viabilität, wenn es schnell und bei einer Temperatur < 15 C abgekühlt wird Samenzellen von Eber, Bulle, Bock sind empfindlicher gegenüber dem Kälteschock Auswirkungen des Kälteschocks: Herabsetzung der Motilität Freisetzung von Enzymen Ionentransport über die Membran Verlust von Membranlipiden

73 Methoden der Spermakonservierung Konservierung bei Temperaturen über dem Nullpunkt (Flüssigsperma) bei Kühlschranktemperatur (+5 C) bei Raumtemperatur (+15 bis 25 C) Tiefgefrierkonservierung TG-Verfahren oder LN 2 -Verfahren (bei 196 C)

74 Samenkonservierung Unter Kryokonservierung (von griechisch κρύος, krýos = Kälte und lateinisch conservare = erhalten, bewahren) versteht man das Aufbewahren von Zellen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, die Vitalität der Zellen nahezu unbegrenzt aufrechtzuerhalten, obgleich das biologische System in den Aggregatzustand eines Festkörpers übergeht.

75 Tiefgefrierkonservierung Üblich: Bulle, Bock, Hengst, Rüde Unüblich: Eber

76 Tiefgefrierkonservierung Phasen Spermagewinnung und -beurteilung Spermaverdünnung und -konfektionierung Spermaäquilibrierung Spermatiefgefrierung Temperaturverschiebung C C * 23 5 C C Spermalagerung C Auftauen C **

77 (Quelle: Dr.-Arbeit Dr. Diana Wagner, 2007) Tiefgefrierkonservierung

78 Tiefgefrierkonservierung Manuelles Einfriergerät NICOOL LM10 Halbautomatisches Einfriergerät NICOOL BAG MS21 (Quelle: Internet)

79 Tiefgefrierkonservierung PC-gesteuerte Einfriergeräte MINICOOL 40 PC und NICOOL PLUS PC (Quelle: Internet)

80 Schäden? Prinzipiell überall sensibel Akrosom & DANN.

81 Take Home Fragen 1. Welche Arten der Konservierung von Sperma kennen Sie? 2. Bei welcher Tierart sind die Spermien besonders kälteempfindlich? 3. Welchem Zweck dienen Verdünner? 4. Welchem Zweck dienen Antibiotika im konserviertem Sperma & welche Anforderungen bestehen an sie? 3. Was verstehen Sie unter Kryokonservierung?